ביצוע מסך CRISPR רחב גנום במבחנה בתאי T של קולטן אנטיגן כימרי
31 בינואר 2025
המאמר מתאר פרוטוקול ליישום מודל in vitro לתשישות כדי להשלים מסך נוקאאוט CRISPR כלל גנומי בתאי T קולטן אנטיגן כימרי בריא מתורם.
טיפול בתאי T לרכב הוא סוג חדשני של אימונותרפיה לסרטן שהוביל להפוגות שנמשכות למעלה מעשור. עם זאת, שיעורי התגובות העמידות עדיין מוגבלים. באמצעות פרוטוקול זה, אנו שואפים לשפר את ההבנה שלנו לגבי המנגנונים שמאחורי ההתנגדות וליצור כלים לשיפור התגובה לטיפול בתאי CAR T.
כיום משתמשים בגישות רבות לשיפור הטיפול בתאי CAR T, כולל טיפולים משולבים ואופטימיזציה של תכנון CAR. עם זאת, עקב עדויות הולכות וגוברות לכך שהפרופיל האפיגנטי של מוצרי תאי T CAR לפני עירוי הוא תגובה דטרמיניטיבית חשובה, טכנולוגיות עריכה גנטית הפכו לכלים פופולריים.
עריכה גנומית של תאי CAR T הראתה הצלחה במניעת רעילות והגברת ההתפשטות וההתמדה של תאי CAR T במחקרים פרה-קליניים וקליניים. הפרוטוקול שלנו למסך נוקאאוט של CRISPR בכל הגנום מספק גישה יעילה וחסרת פניות לקביעת העריכות הגנטיות הטובות ביותר לשיפור תפקוד תאי CAR T.
הפרעות בגנים ברחבי הגנום דורשות תנאי בחירה בקנה מידה גדול ומתאימים כדי להיות יעילים. כדי לחקור את ההתפתחות של תשישות תאי CAR T, למדנו שעלינו לעורר יותר מ-80 מיליון תאי CAR T במשך שבועיים כדי לבחור עריכות גנים אופטימליות.
בעוד שהפרוטוקול שלנו תוכנן להעריך את התפתחות התשישות, ניתן להתאים פרוטוקול זה כדי להעריך את התפתחותם של מנגנוני עמידות אחרים. על ידי השלמת מסכים ברחבי הגנום בסביבות שונות, אנו עשויים בסופו של דבר לקבוע את העריכות הטובות ביותר לשיפור התגובות הכוללות לטיפול בתאי CAR T.
[קריין] לאחר התמרת תאי ה-CAR T עם ספריית ה-CRISPR, צנטריפוגה את הדגימות ב-300 גרם למשך חמש דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לשטוף אותן. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הדגימות ב-20 מיליליטר של מדיום תאי T. כדי לשמר דגימות לריצוף הדור הבא, יש לצרף מספיק תאי CAR T לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר כדי לשמור על ייצוג RNA מנחה של 500 תאים לכל RNA מנחה. צנטריפוגה את הדגימה ב-300 גרם למשך חמש דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן השעו מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של PBS והעבירו אותה לצינור מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר. שטפו את הצינור החרוטי בנפח 50 מיליליטר עם מיליליטר אחד של PBS והעבירו את הכביסה לאותו צינור מיקרו-צנטריפוגה. לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימות ב-500 גרם למשך חמש דקות ב-4 מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט ואחסן את כדורי התא בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. כדי להתחיל בתרבית המשותפת, הוסף תאי CAR T לתאי JeKo-1 חיוביים ל-CD19 ביחס של אחד לאחד. הביאו את הנפח הכולל של התרבות המשותפת ל-160 מיליליטר עם מדיום תאי T ואחסנו את הדגימות באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. כדי לעורר מחדש את תאי ה-CAR T, אספו את התרביות המשותפות לצינורות חרוטיים של 50 מיליליטר וצנטריפוגות את הדגימות ב-300 גרם למשך חמש דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השעו מחדש כל דגימה ב-80 מיליליטר של מדיום תאי T והוסיפו 80 כפול 10 לעוצמה של שישה תאי JeKo-1 ב-80 מיליליטר של מדיום תאי T. אחסן את הדגימות בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. ביום ה-15, כדי לבודד את תאי ה-CAR T מהתרבית המשותפת, ספרו תחילה את התאים. שלב ערכת בחירה חיובית עבור תאי T חיוביים ל-CD4 עם ערכת בחירה חיובית לתאי T חיוביים ל-CD8 כדי לבודד תאי T מתרביות CAR T JeKo-1. לאחר מכן ספרו את תאי ה-T המבודדים. כדי לשמר את הדגימות לריצוף הדור הבא, יש לצטט 33 כפול 10 בחזקת שישה תאי CAR T לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר ולצנטריפוגה את הדגימה ב-300 גרם למשך חמש דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השעו מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של PBS והעבירו אותה לצינור מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר. לאחר מכן שטפו את הצינור החרוטי בנפח 50 מיליליטר עם מיליליטר PBS והעבירו את הכביסה לאותו צינור מיקרו-צנטריפוגה. לאחר צנטריפוגה של הדגימות והסרת הסופרנטנט, אחסן את כדורי התא בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. כדי להתחיל, בודד DNA גנומי מכדורי תאי CAR T קפואים באמצעות ערכת בידוד DNA גנומית. טהר את ה-DNA הגנומי המבודד באמצעות משקעי אתנול על ידי קירור מוקדם של 100% אתנול ל-20 מעלות צלזיוס. ציטוט את ה-DNA המנומק באופן שווה למספר צינורות מיקרו-צנטריפוגה, וודא שכל אליקוט הוא 200 עד 250 מיקרוליטר. הוסף שני נפחים של 100% אתנול מקורר מראש, 0.1 נפח של שלושה נתרן אצטט מולארי ומיקרוליטר אחד של 20 מיליגרם למיליליטר גליקוגן. דגרו את הדגימות למשך הלילה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. ביום השני, סובבו את הדגימות ב-13,000 גרם למשך 20 דקות כדי לגלול את ה-DNA המשקע. הסר את הסופרנטנט ושטוף את הכדורים עם מיליליטר אחד של 70% אתנול על ידי סיבוב ב-7,500 גרם למשך 10 דקות. לאחר ייבוש מוחלט של הכדורים, השעו מחדש את הכדורים ב -50 מיקרוליטר מים סטריליים. כדי להכין את ה-DNA הגנומי לריצוף הדור הבא, הגדר PCR עם תערובת התגובה שצוינה המוצגת כאן. לאחר מכן בצע את ה-PCR באמצעות תנאי הרכיבה הבאים. משוך את תגובות ה-PCR עבור כל דגימה וטהר את מוצר ה-PCR באמצעות ערכת טיהור PCR בהתאם להוראות היצרן. יש להריץ שלושה מיקרוגרם של מוצר ה-PCR עבור כל דגימה על ג'ל אגרוז 2%. הסר את מוצר ה-PCR מהג'ל על ידי חילוץ ה-DNA באמצעות ערכת מיצוי ג'ל לפי הוראות היצרן. אחסן את הדגימות שחולצו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול ליישום מודל תשישות (exhaustion) in vitro לצורך ביצוע סריקת CRISPR knockout גנומית רחבה בתאי T עם קולטן אנטיגני כימרי (CAR T cells) מתורמים בריאים. המטרה היא להעמיק את ההבנה של מנגנוני העמידות בטיפול בתאי CAR T.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- אימונותרפיה
- עריכה גנטית
- מחקר סרטן
רקע
- טיפול בתאי CAR T הוא טיפול מבטיח לסרטן.
- תגובות בר-קיימא לטיפול נותרות מוגבלות.
- הבנת מנגנוני העמידות חיונית לשיפור התוצאות.
- טכנולוגיות לעריכה גנטית נמצאות בשימוש גובר בתחום זה.
מטרת המחקר
- לחקר המנגנונים העומדים בבסיס העמידות לטיפול בתאי CAR T.
- לפיתוח כלים המשפרים את היעילות של תאי CAR T.
- לניצול טכנולוגיית CRISPR לסריקה רחבה של הגנום.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מודל in vitro של תשישות המיושם על תאי T.
- מתודולוגיה לסריקת knockout באמצעות CRISPR ברמה גנומית.
- ניתוח של פרופילים אפיגנטיים של תוצרי תאי CAR T.
- הערכה של מנגנוני תגובה בתאי תורם בריאים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי גורמים גנטיים מרכזיים המשפיעים על תגובות של תאי CAR T.
- תובנות לגבי הנוף האפיגנטי המשפיע על תוצאות הטיפול.
- מסלולים פוטנציאליים להגברת יעילות תאי CAR T.
- ביסוס של פרוטוקול סריקה חסון למחקרים עתידיים.
מסקנות
- המחקר מספק מסגרת להבנת עמידות לתאי CAR T.
- סריקת knockout באמצעות CRISPR יכולה לחשוף תובנות גנטיות קריטיות.
- הממצאים עשויים להוביל לאסטרטגיות משופרות לטיפול בתאי CAR T.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית ניהולית
סריקת knockout של CRISPR ברחב הגנום בתאי CAR T מאפשרת זיהוי סיסטמטי של גורמים גנטיים העומדים בבסיס עמידות ותשישה, דבר המשפיע ישירות על רמת הביטחון בחיזוי של אופטימיזציה לטיפול תאי. גישה זו תומכת בהפחתת סיכונים מוקדמת של עריכות מועמדות ומספקת מידע לקבלת החלטות ברמת הפורטפוליו עבור אימונותראפיה מהדור הבא. שילוב של הפרעה גנטית בלתי מוטה עם תוצאות תפקודיות מציב את זרימת העבודה זו בנקודת מפנה קריטית עבור מחקר ופיתוח טרנסלציונלי של טיפול תאי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה מקיפה של תפקוד גנים בתהליכי תשישה ועמידות של תאי CAR T.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי קישור עריכות גנים לתוצאות פנוטיפיות בתאים ראשוניים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים של מטרות מועמדות לפני השקעה בשלבים מאוחרים יותר.
- משפר את הביטחון החזוי בהעברת עריכות גנים למודלים פרה-קליניים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מקימה פלטפורמה ניתנת להרחבה ולשחזור עבור הפרעה (perturbation) ברמה הגנומית בתאי CAR T ראשוניים.
- מספקת תוצאות כמותיות המתאימות לניתוח בספיקה גבוהה ולריצוף דור הבא.
- מאפשרת סטנדרטיזציה חסונה של הבדיקה לצורך השוואה בין מחקרים ובין צוותים.
- מכינה מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור סריקות פונקציונליות ומכניסטיות המשך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה אסטרטגיות לעריכה גנטית למודלים רלוונטיים למחלה של תשימות תאי CAR T.
- תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מנגנוני עמידות.
- מספק מסגרת לקידום מותאם-סיכון של מבני CAR מותאמים.
- מאפשר גילוי של סממנים ביולוגיים תרגומיים הקשורים לעריכות גנים פונקציונליות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
סריקת CRISPR knockout גנומית זו משתלבת בממשק שבין הגילוי המוקדם לתיקוף הפרה-קליני, ומגשרת בין זיהוי מטרות להערכה תפקודית בתאי CAR T אנושיים ראשוניים.
- ביולוגיה של גילוי: בוחן באופן שיטתי השערות גנטיות העומדות בבסיס העמידות והתשישות של תאי CAR T.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך תיעדוף עריכות גנים.
- אנליטיקה: מספק נתוני ריצוף מהדור הבא להשוואה סטטיסטית חסונה של הפרעות גנטיות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין תוצאות עריכת גנים לבין פנוטיפים תפקודיים רלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת סריקה ניתנת לשימוש חוזר, הניתנת להתאמה למגוון מבני CAR ומודלים של גידולים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית באופטימיזציה של תאי CAR T.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של תהליכי עריכה גנטית וסריקה בקנה מידה רחב בתאים ראשוניים.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go עבור עריכות גנטית ועיצובי CAR, ובכך משפר את הקצאת ההון.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של אסטרטגיות עריכה גנטית בתוכניות לטיפול תאי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרבית תאי מקור בקנה מידה גדול וטיפול בספריות CRISPR.
- מחייב גישה לרצף דור הבא (next-generation sequencing) ותשתית ביואינפורמטיקה מתקדמת.
- מצריך סטנדרטיזציה קפדית בין הצוותים לייצוג ה-guide RNA ולעיבוד דגימות.
- ניתן להתאמה למבני CAR שונים ולמודלים של גידולים באמצעות שינויים בפרוטוקול.
- תלוי במספר תאים מספיק ובעומק רצף (sequencing depth) כדי להשיג עוצמה סטטיסטית חסונה.
