Name: ביצוע מסך CRISPR רחב גנום במבחנה בתאי T של קולטן אנטיגן כימרי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: למד כיצד לבצע מסך CRISPR רחב גנום בתאי T של קולטן אנטיגן כימרי לחקירת מנגנוני עמידות בטיפול אימונותרפי בסרטן. השיטה מאפשרת זיהוי גורמים גנטיים קריטיים לשיפור יעילות התאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>מסכי CRISPR רחבי גנום בתאי CART לחקר עמידות לטיפול

<ol><li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-year+follow-up+supports+curative+potential+of+axicabtagene+ciloleucel+in+refractory+large+B-cell+lymphoma+%28zuma-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">5-year follow-up supports curative potential of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (zuma-1).</a> Blood. 141 (19), 2307-2315 (2023).</li>
<li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axicabtagene+ciloleucel+CAR+T-cell+therapy+in+refractory+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma.</a> N Engl J Med. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li>
<li>Locke, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+and+activity+of+axicabtagene+ciloleucel+in+refractory+large+B-cell+lymphoma+%28zuma-1%29%3A+A+single-arm%2C+multicentre%2C+phase+1-2+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Long-term safety and activity of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (zuma-1): A single-arm, multicentre, phase 1-2 trial.</a> Lancet Oncol. 20 (1), 31-42 (2019).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+children+and+young+adults+with+B-cell+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia.</a> N Engl J Med. 378 (5), 439-448 (2018).</li>
<li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+adult+relapsed+or+refractory+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma.</a> N Engl J Med. 380 (1), 45-56 (2018).</li>
<li>Bai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+antigen-specific+landscape+of+CAR+T+infusion+product+identifies+determinants+of+CD19-positive+relapse+in+patients+with+all%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Single-cell antigen-specific landscape of CAR T infusion product identifies determinants of CD19-positive relapse in patients with all.</a> Sci Adv. 8 (23), eabj2820(2022).</li>
<li>Fraietta, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nat Med. 24, 563-571 (2018).</li>
<li>Gennert, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+chromatin+regulatory+landscape+of+human+CAR+T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dynamic chromatin regulatory landscape of human CAR T cell exhaustion.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 118 (30), e2104758118(2021).</li>
<li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+anti-CD19+CAR+T+cell+infusion+products+associated+with+efficacy+and+toxicity+in+patients+with+large+B+cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Characteristics of anti-CD19 CAR T cell infusion products associated with efficacy and toxicity in patients with large B cell lymphomas.</a> Nat Med. 26 (12), 1878-1887 (2020).</li>
<li>Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+CRISPR%2FCAS9+to+knock+out+GM-CSF+in+CAR-T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using CRISPR/CAS9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells.</a> J Vis Exp. (149), e59629(2019).</li>
<li>Sterner, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+inhibition+reduces+cytokine+release+syndrome+and+neuroinflammation+but+enhances+CAR-T+cell+function+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts.</a> Blood. 133 (7), 697-709 (2019).</li>
<li>Cox, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+disruption+in+CART+cells+modulates+T+cell+activation+and+enhances+CART+cell+anti-tumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">GM-CSF disruption in CART cells modulates T cell activation and enhances CART cell anti-tumor activity.</a> Leukemia. 36 (6), 1635-1645 (2022).</li>
<li>Ottaviano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+1+clinical+trial+of+CRISPR-engineered+CAR19+universal+T+cells+for+treatment+of+children+with+refractory+B+cell+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Phase 1 clinical trial of CRISPR-engineered CAR19 universal T cells for treatment of children with refractory B cell leukemia.</a> Sci Transl Med. 14 (668), eabq3010(2022).</li>
<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-CAS9+knockout+and+transcriptional+activation+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-CAS9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protoc. 12, 828-863 (2017).</li>
<li>Mccutcheon, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+epigenetic+regulators+of+human+CD8%2B+T+cell+function+identified+through+orthogonal+CRISPR+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and epigenetic regulators of human CD8+ T cell function identified through orthogonal CRISPR screens.</a> Nat Genet. 55, 2211-2223 (2023).</li>
<li>Zhu, W., Kelly, C., Dagur, P., Dunbar, C. E., Cordes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+activation+screen+to+optimize+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+immunophenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CRISPR activation screen to optimize chimeric antigen receptor (CAR) T cell immunophenotype.</a> Blood. 142 (Supplement 1), 4820-4820 (2023).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+screening+of+CAR+T+cells+and+cancer+stem+cells+reveals+critical+dependencies+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">CRISPR screening of CAR T cells and cancer stem cells reveals critical dependencies for cell-based therapies.</a> Cancer Discov. 11 (5), 1192-1211 (2021).</li>
<li>Shifrut, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+CRISPR+screens+in+primary+human+T+cells+reveal+key+regulators+of+immune+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide CRISPR screens in primary human T cells reveal key regulators of immune function.</a> Cell. 175 (7), 1958-1971.e15 (2018).</li>
<li>Belk, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+crispr+screens+of+T+cell+exhaustion+identify+chromatin+remodeling+factors+that+limit+T+cell+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide crispr screens of T cell exhaustion identify chromatin remodeling factors that limit T cell persistence.</a> Cancer Cell. 40 (7), 768-786.e7 (2022).</li>
<li>Jiang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ATAC-seq+maps+the+comprehensive+and+dynamic+chromatin+accessibility+landscape+of+CAR-T+cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Single-cell ATAC-seq maps the comprehensive and dynamic chromatin accessibility landscape of CAR-T cell dysfunction.</a> Leukemia. 36 (11), 2656-2668 (2022).</li>
<li>Rossi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preinfusion+polyfunctional+anti-CD19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+are+associated+with+clinical+outcomes+in+NHL%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Preinfusion polyfunctional anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with clinical outcomes in NHL.</a> Blood. 132 (8), 804-814 (2018).</li>
<li>Beider, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+signatures+associated+with+CAR+T+cell+exhaustion+and+impaired+clinical+response+in+patients+with+B+cell+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional signatures associated with CAR T cell exhaustion and impaired clinical response in patients with B cell malignancies.</a> Cells. 11 (7), 1140(2022).</li>
<li>Wherry, E. J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">cell exhaustion.</a> Nat Immunol. 12, 492-499 (2011).</li>
<li>Prinzing, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleting+DNMT3A+in+CAR+T+cells+prevents+exhaustion+and+enhances+antitumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Deleting DNMT3A in CAR T cells prevents exhaustion and enhances antitumor activity.</a> Sci Transl Med. 13, eabh0272(2021).</li>
<li>Lynn, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-jun+overexpression+in+CAR+T+cells+induces+exhaustion+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">C-jun overexpression in CAR T cells induces exhaustion resistance.</a> Nature. 576, 293-300 (2019).</li>
<li>Tang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+inhibition+via+CRISPR+promotes+the+long-term+efficacy+of+CAR+T+cells+against+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">TGF-beta inhibition via CRISPR promotes the long-term efficacy of CAR T cells against solid tumors.</a> JCI Insight. 5 (4), e133977(2020).</li>
<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-CAS9+knockout+and+transcriptional+activation+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-CAS9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control%2C+modeling%2C+and+visualization+of+CRISPR+screens+with+MAGeCK-VISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR.</a> Genome Biol. 16, 281(2015).</li>
<li>Sakemura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cancer-associated+fibroblasts+in+the+bone+marrow+prevents+resistance+to+CART-cell+therapy+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeting cancer-associated fibroblasts in the bone marrow prevents resistance to CART-cell therapy in multiple myeloma.</a> Blood. 139 (26), 3708-3721 (2022).</li>
<li>Stewart, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-4+drives+exhaustion+of+CD8%2B+CART+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">IL-4 drives exhaustion of CD8+ CART cells.</a> Nat Commun. 15 (1), 7921(2024).</li>
<li>FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Babraham Bioinformatics. 
 <a target="_blank" href=" https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/"> https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Bbmerge. , 
 <a target="_blank" href=" https://github.com/BioInfoTools/BBMap/blob/master/sh/bbmerge.sh"> https://github.com/BioInfoTools/BBMap/blob/master/sh/bbmerge.sh</a> (2019).</li>
<li>Pattanayak, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+profiling+of+off-target+DNA+cleavage+reveals+RNA-programmed+CAS9+nuclease+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed CAS9 nuclease specificity.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 839-843 (2013).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-CAS9-mediated+gene+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-CAS9-mediated gene inactivation.</a> Nat Biotechnol. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li>
<li>Dong, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+immunotherapy+target+discovery+using+genome-scale+in+vivo+CRISPR+screens+in+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic immunotherapy target discovery using genome-scale in vivo CRISPR screens in CD8 T cells.</a> Cell. 178 (5), 1189-1204.e23 (2019).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+CRISPR+screens+in+vivo+map+T+cell+fate+regulomes+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell CRISPR screens in vivo map T cell fate regulomes in cancer.</a> Nature. 624 (7990), 154-163 (2023).</li>
<li>Sutra Del Galy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+CRISPR+screens+identify+SOCS1+as+intrinsic+checkpoint+of+CD4%2B+TH1+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide CRISPR screens identify SOCS1 as intrinsic checkpoint of CD4+ TH1 cell response.</a> Sci Immunol. 6 (66), eabe8219(2021).</li>
<li>Ramos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-intrinsic+determinants+of+CAR-T+response+revealed+by+iterative+in+vivo+genome-wide+CRISPR+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Leukemia-intrinsic determinants of CAR-T response revealed by iterative in vivo genome-wide CRISPR screening.</a> Nat Commun. 14 (1), 8048(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>293 תאי T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>תאים המשמשים לייצור לנטי-וירוס</td></tr><tr><td>ביוטין ProteinL נוגדן</td><td>GenScript</td><td>M00097</td><td>נוגדן נגד שרשרת קאפה לזיהוי CAR</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>מלח קרבניצילין דיסודיום</td><td>Millipore Sigma</td><td>C1389-1G</td><td>אנטיביוטיקה קרבניצילין</td></tr><tr><td>CD4 בידוד חרוזים</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי בידוד CD8</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-201</td><td></td></tr><tr><td>CTS (מערכות טיפול בתאים) Dynabeads CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>ציטופלקס</td><td>בקמן קולטר</td><td>NC2279958</td><td></td></tr><tr><td>מים ללא DNase-Free</td><td>Invitrogen</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM)</td><td>קורנינג</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered</td><td>Salt Late Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human T Cell Isolation Kit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>17951RF</td><td>ערכת בידוד שלילי</td></tr><tr><td>Endura Electrocompetence Cells&nbsp;</td><td>Biosearch Technologies</td><td>60242-1</td><td>תאים מוכשרים עם מדיום התאוששות</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td> <td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>GeCKO v2 CRISPR Knockout Pooled Library A</td><td>AddGene</td><td>1000000048</td><td>ספריית CRISPR פלסמיד</td></tr><tr><td>Gene Pulser II&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2105</td><td>Electroporator</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Millipore Sigma</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>JeKo-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td>CD19+ תאי מטרה&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000075</td><td>ערכת ריאגנטים של Transfection עם מגיב טרנספקציה (Lipofectamine 3000 Reagent) ומגיב קו-ליפיד ניטרלי (p3000)</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Aqua</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7851</td><td>שיפוע צפיפות בינוני</td></tr><tr><td>Machery-Nagel NucleoBond Xtra Maxi ערכות</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12748412</td><td>ערכת הכנה מקסי</td></tr><tr><td>NEBNext נאמנות גבוהה 2X PCR MasterMix</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>M0541S</td><td>נאמנות גבוהה PCR mastermix</td></tr><tr><td>Opti-MEM I סרום מופחת בינוני</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>סרום מופחת</td></tr><tr><td>בינוני pCMVR8.74</td><td>AddGene</td><td>22036</td><td>אריזת Lentiviral פלסמיד</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>AddGene</td><td>12259</td><td>מעטפת VSV-G המבטאת פלסמיד</td></tr><tr><td>סרום AB אנושי מאוחד&nbsp;</td><td>מחקר חדשני</td><td>ISERABHI</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Millipore Sigma</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick ג'ל מיצוי ערכת</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>ערכת מיצוי Gek</td></tr><tr><td>Qucik-DNA Midiprep Plus Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4075</td><td>ערכת המשמשת לבידוד gDNA</td></tr><tr><td>RoboSep-S</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>21000</td><td>מפריד</td></tr> <tr><td>תאים אוטומטימכון הזיכרון רוזוול פארק 1640 בינוני (RPMI)</td><td>Gibco</td><td>21870092</td><td></td></tr><tr><td>SepMate-50</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85450</td><td>צינור הפרדת שיפוע צפיפות</td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td>Invitrogen</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>71448-16</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן סטרפטווידין (PE)</td><td>BioLegend</td><td>405203</td><td>נוגדן משני משמש לזיהוי CAR</td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge (Optima XPN-80)</td><td>BeckmanCoulter</td><td>A99839</td><td></td></tr><tr><td>מערכות סינון ואקום, 0.22 ומיקרו; m</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>567-0020</td><td></td></tr><tr><td>מערכות סינון ואקום, 0.45 ומיקרו; m</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>165-0045</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 מדיום תאים המטופויאטיים ללא סרום</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td>מדיום תאים המטופויאטיים</td></tr></tbody></table>

ביצוע מסך crispr רחב גנום במבחנה בתאי t של קולטן אנטיגן כימרי

Performing an In Vitro Genome-Wide CRISPR Knockout Screen in Chimeric Antigen Receptor T Cells

כדי לחקור גנים ומסלולים שניתן לערוך כדי לשפר את פעילות תאי ה-CART באופן בלתי מוטה, תכננו מסך נוקאאוט CRISPR רחב גנום במבחנה (איור 1). למסך זה שני שלבים: שלב ייצור תאי CART ושלב לחץ סלקטיבי. בשלב ייצור תאי CART, לפחות 110 ×10 6 תאי T מבודדים תחילה מ- PBMCs תורמים בריאים ומופעלים עם חרוזי CD3+/CD28+. למחרת, ביום הראשון, מוסיפים לנטיוירוס CAR ב-MOI של 3.0 כדי לייצר תאי CART המכוונים לאנטיגן CD19 (תאי CART19). ביום השני,...

ביצוע מסך CRISPR רחב גנום במבחנה בתאי T של קולטן אנטיגן כימרי

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy is an innovative form of targeted immunotherapy that has revolutionized the treatment of cancer. However, ...

performing-an-vitro-genome-wide-crispr-knockout-screen-chimeric

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

סרטון זה מדגים טכניקה לייצור קולטן אנטיגן כימרי (CAR) תאי T ex vivo. תאי T אנושיים מודגרים בחרוזים מגנטיים המצופים בנוגדנים נגד CD3 ונגד CD28, יחד עם מדיום בתוספת אינטרלוקין-2 (IL-2), המוביל להפעלה ושגשוג של תאי T. מוצגים וקטורים לנטי-ויראליים טרנסגניים, המאפשרים לרנ"א המהונדס להשתלב בגנום המארח ולבטא את הטרנסגן. התוצאה היא שתאי T המומרים מבטאים קולטני אנטיגן כימריים (CARs) על פני השטח שלהם. תאי T נקצרים בנקודות זמן מוגדרות כדי להעריך ביטוי CAR ושימור בהקפאה.

טכניקת Ex Vivo לייצור תאי T קולטני אנטיגן כימריים

סרטון זה מדגים טכניקה ליצירת תאי T מסוג קולטן אנטיגן כימרי ספציפי לגידול (CAR). וקטורים רטרו-ויראליים הנושאים RNA מהונדס מעורבבים עם תאי טחול בתווך בתוספת אינטרלוקין-2 כדי לקדם הישרדות ושגשוג של תאי T. לאחר מכן התערובת מועברת לצלחת המצופה במקטעי פיברונקטין אנושיים רקומביננטיים וצנטריפוגה כדי להקל על איחוי הנגיף עם התא, מה שמאפשר לרנ"א להשתלב בגנום המארח ולייצר מכוניות הקשורות לפני השטח המכוונות לאנטיגן הגידול.

טכניקת Ex Vivo ליצירת תאי T קולטני אנטיגן כימריים ספציפיים לגידול

כאן נתאר שיטת הפריה תרבות משותפת כדי באופן רקורסיבי אתגר, ממוקדות גידול תאי T, המאפשר ניתוח פנוטיפי ופונקציונליים של פעילות antitumor תא T...

ב- Rechallenge תא הגידול חוץ גופית להערכה חזוי של Chimeric אנטיגן קולטן תא T פונקציה Antitumor

CRISPR-Cas9 הטכנולוגיה מספקת שיטה יעילה בדיוק לערוך את הגנום היונקים בסוג תא כלשהו ומייצג את האמצעים הרומן לבצע מסכי גנטי רחב הגנום. פרוטוקול מפורט לדון בצעדים הנדרשים עבור ביצועים מוצלחים של מסכי CRISPR-Cas9 הגנום הרחב מסופק כאן.

מסכי גנטי מבוססי CRISPR במאגר תאים ממיונקים

כאן אנו מתארים מתודולוגיית הקרנה מהירה וישירה vivo CRISPR /Cas9 באמצעות אולטרסאונד מונחה זריקות lentiviral עוברי הרחם כדי להעריך בו זמנית פונקציות של מספר גנים בעור וחלל הפה של עכברים immunocompetent.

ב Vivo CRISPR / Cas9 הקרנה בו זמנית להעריך תפקוד גנים בעור העכבר וחלל הפה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לעריכת גנים בתאי T אנושיים ראשוניים באמצעות טכנולוגיית CRISPR Cas לשינוי תאי CAR-T.

ייצור תאי CAR-T מהונדסים על-ידי CRISPR האנושי

פרוטוקול זה מייעל את הייצור הווקטורי הרטרו-ויראלי ואת התמרת תאי T מורין, ומאפשר ייצור יעיל של תאי CAR-T בעכבר.

ייצור יעיל של תאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T

פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה יעילה ליצירה ובדיקה של תאי T רגולטוריים של קולטני אנטיגן כימריים אנושיים (CAR Tregs).

יצירת תאי T רגולטוריים של קולטן אנטיגן כימרי אנושי

כאן, אנו מתארים שיטה ליצירת טיפות תחליב כפולות המכילות תא T אחד ותא מטרה סרטני כדי לבחון הרג תאים ברמת התא הבודד. שיטה זו מאפשרת כימות כפול הן של מולקולות ציטוטוקסיות והן של אפופטוזיס של תאי מטרה בתוך אוכלוסייה גדולה של תאי T.

בדיקת ציטוטוקסיות מבוססת טיפות להערכת תאי T קולטני אנטיגן כימריים ברמת התא הבודד

פיתחנו פרוטוקול סקר CRISPR-Cas9 אופטימלי לתאי CAR T ראשוניים. על ידי הפחתת העברת ה-gDNA באמצעות עיכול אנזימטי ומשיכת קלטת sgRNA, גישה זו ממזערת ארטיפקטים של PCR, ומבטיחה זיהוי מדויק של sgRNA וזיהוי חזק של מטרות גנים פונקציונליות.

שיפור מסכי CRISPR-Cas9 בתאי CAR T – שיטה משופרת להכנת ספרייה

למד כיצד לבצע מסך CRISPR רחב גנום בתאי T של קולטן אנטיגן כימרי לחקירת מנגנוני עמידות בטיפול אימונותרפי בסרטן. השיטה מאפשרת זיהוי גורמים גנטיים קריטיים לשיפור יעילות התאים.

ביצוע מסך CRISPR רחב גנום במבחנה בתאי T של קולטן אנטיגן כימרי

גלה סרטונים נוספים