הקמת מודלים אורתוטופיים של קסנוגרפט שמקורם בחולה לגידולי מוח באמצעות מכשיר סטריאוטקסי

במחקר שלי אנו מתמקדים בפיתוח טיפולים חדשים לסרטן מוח אגרסיבי בילדות כמו גליומות מפושטות בקו האמצע, גליומות בדרגה גבוהה, אפנדימומות ואמלובלסטומות. מטרתנו היא למצוא מטרות תרופתיות חדשות ולפתח טיפולים שיכולים לחולל שינוי במטופלים, תוך חקר האופן שבו גידולים אלה עשויים להשפיע על סביבת המוח הסובבת. במחקר גידולי מוח בילדים, פיתחנו מודלים של קסנוגרפט שמקורם במטופלים באמצעות זריקות תוך גולגולתיות, הדמיה מתקדמת וסינון תרופות בתפוקה גבוהה.

טכניקות כמו תא בודד ותעתיק מיוחד מסייעות לנו להבין כיצד הגידול משפיע על סביבת המוח ועל השפעות הטיפול, ומאפשרות לנו לחקור טיפולים חדשים. קבוצת גידולי המוח שלנו במכון לסרטן ילדים פיתחה מודלים רבים של רפואת ילדים לגידולי מוח בילדים באמצעות התוכנית לרפואה מותאמת אישית של אפס סרטן בילדות. מצאנו שגליומות מפוזרות בקו האמצע עמידות לטיפולים תרופתיים בגלל מחסום דם-מוח שלם.

טיפולים מבטיחים המכוונים למסלולים האפיגנטיים והאונקוגניים שיפרו את הישרדות הילדים ונמצאים כעת בפיתוח קליני. באמצעות מודלים אורתוטופיים של גידולי מוח, ברצוננו להבין כיצד גידולים משפיעים על כלי הדם במוח. על ידי יישום טכניקות כמו טרנסקריפטומיקה מיוחדת, ברצוננו לזהות מסלולים המושפעים מגידולי מוח.

ידע זה יעזור לנו לזהות מודולטורים של מחסום דם-מוח שיכולים לשחרר את המחסום, ולאפשר לטיפולים תרופתיים לחדור בצורה יעילה יותר. כדי להתחיל, הפשירו תאי גידול מוח מתורבתים היוצרים נוירוספרה. בארון בטיחות ביולוגית, הוציאו בזהירות את התאים המתורבתים ומדיום התרבית מבקבוק תרבית הרקמה לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר עם פיפטה סרולוגית.

צנטריפוגה את הצינור החרוטי ב -300 גרם למשך עד חמש דקות בטמפרטורת החדר. בעזרת פיפטה של 25 מיליליטר, שאפו את המדיום מעל הגלולה והשאירו כ- 0.5 מיליליטר בצינור. פיפטה בעדינות את התאים למעלה ולמטה 10 פעמים עם פיפטה של מיליליטר אחד כדי לנתק את גלולת התא.

הוסף טריפן כחול לתרחיף התא וספור בעזרת המוציטומטר. תרחיף תאים Aliquot המכיל שני מיליון תאים לתוך צינור טרי. הוסף 0.5 מיליליטר PBS למתלה התא.

ואז צנטריפוגה ב -300 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט ושטפו שוב. לאחר הכביסה האחרונה, שאפו כמה שיותר PBS.

לאחר מכן הניחו את גלולת התא ו -50 מיקרוליטר של הידרוג'ל מטריצה חוץ-תאית על קרח. מערבבים את גלולת התא עם הידרוג'ל מטריצה חוץ-תאית מייד כדי להתכונן להזרקה תוך גולגולתית. כדי להתחיל, הרכיב עכבר מורדם על מכשיר סטריאוטקסי.

ודא שהשיניים הקדמיות מקובעות במוט החותך וחרוט האף מאבטח את החיה במקומה. חטא את ראש העכבר עם קצה כותנה ספוג יוד, ואחריו מגבון איזופרופנול. לאחר מכן יש למרוח משחת עיניים מהקרנית על שתי העיניים כדי למנוע יובש.

בצע חתך בבסיס המוח הקטן והאריך אותו על פני הגולגולת עד לנקודת האמצע כדי ליצור חתך באורך סנטימטר אחד לאורך ההיבט העליון של הגולגולת. הדק את העור בין האוזניים כדי לחשוף את הגולגולת ולאחר מכן הדק את מוטות האוזניים כדי לאבטח את הראש. נקו את משטח הגולגולת וייבשו אותו היטב בעזרת צמר גפן.

אבטח את המקדחה על המסגרת הסטריאוטקסית ואתר את מבנה הברגמה או הלמדואיד באמצעות המקדחה. לאחר קביעת הקואורדינטות, קדחו בזהירות חור קטן בעצם באתר המיועד. השעו מחדש את תרחיף תאי הזרקת גידול המוח המוכן מספר פעמים באמצעות פיפטה, והבטיחו הימנעות מבועות אוויר.

משוך שני מיקרוליטר מתערובת התאים למיקרו-מזרק זכוכית קרה שטוף מראש והצמד את המזרק למסגרת הסטריאוטקסית. כוונן את המחט לקצה הגולגולת כדי להתכונן להזרקה. תוך 30 שניות, הזרקו את התאים לאזור הקדוח.

נגב כל תרחיף תאים עם ריפלוקס עם מגבון איזופרופנול במהלך ההזרקה. השאירו את המזרק במקומו למשך דקה אחת כדי למנוע זרימה חוזרת ולאפשר למטריצה החוץ-תאית הידרוג'ל להתייצב. לאחר מכן הסר את המזרק ונקה את הפצע בעזרת מגבון איזופרופנול.

אטום את החתך עם דבק עור או קליפס פצע במידת הצורך. הנח את העכבר במצב שכיבה בכלוב התאוששות נקי עם חום lamp או כרית חימום כדי לשמור על חום. עקוב אחר החיה ברציפות עד שהיא מתחילה לנוע באופן עצמאי ונורמלי.

לאחר ההזרקה התוך גולגולתית, עקוב אחר העכברים חמישה ימים בשבוע כדי להעריך את רווחתם הכללית. רשום פרמטרים כגון ירידה במשקל, רמת פעילות, יציבה, סימני התייבשות ומצב פרווה על דף ניטור ייעודי. בעלי חיים הראו תסמינים מובהקים המבוססים על סוג הגידול ואתר ההזרקה, כגון הטיית ראש בגידולים בגזע המוח והגדלת המוח הקדמי עבור גליומות קליפת המוח או אפנדימומות.

הזרקות תוך גולגולתיות של תאי מדולובלסטומה D425 בצפיפויות שונות חשפו מתאם ישיר בין צפיפות התאים למהירות השתלת הגידול עם 100,000 תאים שהובילו להישרדות החציונית הקצרה ביותר של 15 יום. תאי גליומה בדרגה גבוהה שהוזרקו לקליפת המוח הביאו להישרדות חציונית של כ-25.5 ימים עם ניתוח אימונוהיסטוכימי שחשף מסת גידול גדולה בעלת גרעין גבוה וכלי דם מוגברים, כמו גם שפע של תאים מתרבים חיוביים ל-Ki-67. הזרקות גזע המוח של תאי גליומה בדרגה גבוהה הביאו להישרדות חציונית של כ-26 ימים עם ניתוח אימונוהיסטוכימי המצביע על מסת גידול בפונים העליונים וחדירת לפטומנינגיאל, כמו גם תאים חיוביים ל-Ki-67 מתרבים באזורים שחדרו.