ניתוח ציטומטריית זרימה של ביטוי גורמי רקמה בטסיות בבני אדם

בפרוטוקול זה, אנו מציעים הדרכה שלב אחר שלב למדידת גורם רקמה הקשור לטסיות על ידי ציטומטריית זרימת דם מלאה, הערכת החלבון בתא התוך תאי, תנאי מעצר ועל פני התא, הן במצב מנוחה והן עם הפעלה עם DP, אחד מגורמי הרקמה האגוניסטים הנפוצים ביותר של טסיות דם מתבטא על ידי תת-קבוצה של טסיות דם. אם טסיות דם חיוביות לגורם רקמה נמדדות בפלזמה עשירה בטסיות PRP, או בטסיות דם שטופות, תת-קבוצה זו עלולה לאבד במהלך הכנת הדגימה. סיכון זה אינו מתרחש כאשר הערכה זו מתבצעת בקיר.

גורם הרקמה הקשור ללוחית הדם היה שנוי במחלוקת מאז הדו"ח הראשון שפורסם בתחילת המאה עקב בעיות פרה-אנליטיות ומתודולוגיות. פרוטוקול זה שופך אור על נושאים אלה ומשמש גם לביצוע פרויקט בינלאומי הנתמך על ידי האגודה הבינלאומית לפקקת והמוסטזיס ISDH לסטנדרטיזציה של מדידת גורמי רקמה הקשורים לטסיות או ציטומטריית זרימת דם מבוצעת על כמה מיקרוליטרים של דם, מה שמאפשר ניתוח גורמי רקמה הקשורים לטסיות המתאים לסביבה הקלינית. יתרה מכך, האפשרות לתקן את הדגימה ולתייג לאחר מכן, הופכת את הניתוח הזה לאפשרי עבור בתי חולים ומעבדות רבים.

כדי להתחיל, הכן מבחנה אחת לכל נפח נוגדנים. כדי לבדוק הוסף טיפה אחת של חרוזים שליליים וטיפה אחת של חרוזים חיוביים לכל מבחנה. הוסף 20 מיקרוליטר מכל דילול נוגדנים למבחנה ולמערבולת.

דגרו מיד את המבחנות בחושך בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של PBS ללא סידן ומגנזיום pH 7.4 לכל צינור ומערבולת, הפוך בעדינות את שואב הסודיום ציטראט חמש פעמים כדי לערבב היטב את הדם ונוגד הקרישה. העבירו 50 מיקרוליטר דם לצינור של 1.5 מיליליטר.

לאחר מכן מוסיפים 950 מיקרוליטר של 1% אלדהיד פרפורם. מערבבים בעדינות ומדגרים את הדגימה למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר. כעת צנטריפוגה את הדגימה ב -1, 500 גרם למשך חמש דקות עם הפסקה בטמפרטורת החדר.

לאחר הסרת ה-supernatant Reese, השעו את הגלולה במיליליטר אחד של PBS ללא סידן ומגנזיום. ב-pH 7.4, יש להוציא 100 מיקרוליטר של דם קבוע לכל צינור ולצנטריפוגה ב-1,500 גרם למשך חמש דקות. עם הפסקה בטמפרטורת החדר, ואז הסר את החייאת הסופרנטנט.

השעו את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של 0.1% טריטון PBS כדי לסרוק את הדגימות ולדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. כדי להתחיל, הכינו צינור אחד לפלואורסצנטיות מינוס בקרה אחת וצינור אחד לצביעה של גורם הרקמה. הוסף נוגדנים ל-100 מיקרוליטר של דם מלא קבוע וסל בכל צינור.

מוסיפים 300 מיקרוליטר PBS ללא סידן ומגנזיום ב-pH 7.4 לכל צינור ומערבבים. לאחר מכן אחסן את הדגימות המוכתמות בחושך עד לניתוח ציטומטריית זרימה לדלל אלפא CD 1 42 HTF נוגדן חד שבטי אחד, ו-Alexa Fluer 6 33 אימונוגלובולין עיזים נגד עכבר G ב-PBS ללא סידן ומגנזיום. לאחר מכן, הכינו שלוש שפופרות דגימה והפיצו PBS ללא סידן ומגנזיום.

ב-pH 7.4, יש להוציא 7.5 מיקרוליטר של אלפא CD מדולל 1 42 htf נוגדן חד-שבטי אחד, ולהוסיף חמישה מיקרוליטרים של אדנוזין דיפוספט. הפוך בעדינות את שואב האבק ציטראט חמש פעמים כדי לערבב היטב את הדם ונוגד הקרישה. יש להוציא חמישה מיקרוליטרים של דם מלא לכל צינור.

מערבבים בעדינות את הדגימות ודוגרים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לקיבוע דגימה, הוסף 300 מיקרוליטר של 1% PFA לכל צינור וצנטריפוגה ב -1, 500 גרם למשך חמש דקות עם הפסקה בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת הסופרנטנט, יש להחיות את הגלולה ב-90 מיקרוליטר PBS ללא סידן ומגנזיום.

ב-pH 7.4 על ידי פיפטינג עדין יש להוציא חמישה מיקרוליטרים של אימונוגלובולין G מדולל Alexa Fluer 6 33 וחמישה מיקרוליטרים של אלפא CD 41 PE לכל צינור. דגרו את הדגימות למשך 15 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. לאחר מכן מוסיפים 300 מיקרוליטר PBS ללא סידן ומגנזיום ב-pH 7.4 לכל צינור ומערבבים.

כדי להתחיל, צור אזור פיזור קדימה ותרשים נקודות של אזור פיזור צדדי בקנה מידה לוגריתמי המציג את כל האירועים, צור תקליטור 61 A ותרשים נקודות של אזור פיזור צדדי בקנה מידה לוגריתמי המציג את כל האירועים. כדי לדמיין את אוכלוסיית טסיות הדם, הגדר את הסף לכ-2000 בגובה הפיזור הצדדי ו-1000 בגובה ה-CP B שש 90 שעות.כוונן את הרווח PE Y 5 8 5 ולכל CP B שש 90 בהתאם לבקרת האיכות היומית והגדר את קצב הזרימה לנמוך. כעת צייר אזור בין 10 קרניים בחזקת שלוש ו-10 קרניים בחזקת חמש הנקרא CD 61 חיובי.

כדי לזהות את אוכלוסיית טסיות הדם, שכפל את ה-FMO ושנה את שמו ל-TFIC. רכוש את הדגימות ורשום קובץ נתונים של 10,000 אירועים בתוך השער החיובי של CD 61. צור אזור פיזור קדימה ואזור פיזור צדדי תרשים נקודות בקנה מידה לוגריתמי המציג את כל האירועים.

צור תקליטור 41 A ותרשים נקודות של אזור פיזור צדדי בקנה מידה לוגריתמי המציג את כל האירועים. לאחר מכן התאם את הרווח של Alexa floor 6 33 ואת הרווח PE wifi 5 8 5 בהתאם לבקרת האיכות היומית. הגדר את הסף בערך ל-1000 בגובה פיזור הצד ול-2,500 ב-PEY 5 85 H.To לדמיין את אוכלוסיית הטסיות, הגדר את קצב הזרימה לנמוך.

כעת צייר אזור בין 10 קרניים בחזקת ארבע ו-10 בחזקת חמש הנקרא CD 41 חיובי כדי לזהות את אוכלוסיית טסיות הדם. לאחר מכן צור צינור לכל דגימה ושם TF Unstimulated ו-TF Stimulated. רכוש את הדגימות ורשום קובץ נתונים של 10,000 אירועים בתוך צנטריפוגת ההליכה החיובית CD 41.

שואב האבק נתרן ציטראט 0.129 מולארי ב-100 גרם למשך 10 דקות ללא הפסקה בטמפרטורת החדר. ואז הסר את השואב מהצנטריפוגה. אסוף את הפלזמה העשירה בטסיות המתקבלות, העביר אותה לצינור פוליפרופילן של 10 מיליליטר ורשום את נפח הטסיות שנאספו פעמיים בפלזמה העשירה בטסיות באמצעות מונה תאי דם.

אוכלוסיית הטסיות שזוהתה על ידי צביעת נוגדנים אלפא CD 61 הראתה כי כ-26.8% מהטסיות במחזור הכילו ניתוח ציטומטריית זרימה של גורם רקמה תוך-תאי הצביע על כך שגורם הרקמה מתבטא בכ-2.8% מהטסיות במנוחה ועולה ל-24.5% עם ההפעלה עם אדנוזין דיפוספט. טסיות בגודל גדול יותר הוכחו כמבטאות רמות גבוהות יותר של גורם רקמה כאשר הנקודות הירוקות מייצגות את תת-קבוצת הטסיות הגדולה יותר. ניתוח ציטומטריית זרימה הראה כי פלזמה עשירה בטסיות שהוכנה באמצעות צנטריפוגה של 100 גרם שימרה אוכלוסייה דומה לדם מלא ושמרה על טסיות בגודל גדול יותר עם גורם רקמה חיובי גבוה יותר.

כוח צנטריפוגה גבוה יותר הוביל לאובדן טסיות חיוביות של גורם רקמה גדול יותר כפי שמצוין על ידי הפיזור הקדמי המופחת באוכלוסיית ה-PRP.