Name: הערכה של שחרור LC3-II באמצעות שלפוחיות חוץ-תאיות ביחס להצטברות שלפוחיות חיוביות ל-LC3 תוך תאיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: חקור את תפקיד האוטופאגיה בשחרור TDP-43 דרך שלפוחיות חוץ-תאיות במחלות נוירודגנרטיביות כמו ALS ו-FTLD-TDP. שיטה זו מסייעת לזהות מטרות טיפוליות חדשות לטיפול במחלות אלו.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>הערכת שחרור EV חיובי LC3-II באוטופגיה עם היתוך ליזוזום לקוי

<ol><li>Tanaka, Y., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profilin+1+mutants+form+aggregates+that+induce+accumulation+of+prion-like+tdp-43%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Profilin 1 mutants form aggregates that induce accumulation of prion-like tdp-43.</a> Prion. 10 (4), 283-289 (2016).</li>
<li>Mehta, P. R., Brown, A. L., Ward, M. E., Fratta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+era+of+cryptic+exons%3A+Implications+for+als-ftd%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">The era of cryptic exons: Implications for als-ftd.</a> Mol Neurodegener. 18 (1), 16(2023).</li>
<li>Kawakami, I., Arai, T., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basis+of+clinicopathological+heterogeneity+in+tdp-43+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The basis of clinicopathological heterogeneity in tdp-43 proteinopathy.</a> Acta Neuropathol. 138 (5), 751-770 (2019).</li>
<li>Chatterjee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+extracellular+vesicle+tau+and+tdp-43+as+diagnostic+biomarkers+in+ftd+and+als%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Plasma extracellular vesicle tau and tdp-43 as diagnostic biomarkers in ftd and als.</a> Nat Med. 30 (6), 1771-1783 (2024).</li>
<li>Kasai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+use+of+csf+nfl+and+csf+tdp-43+improves+diagnostic+performance+in+als%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Transl+Neurol%22%5BJournal%5D)">Combined use of csf nfl and csf tdp-43 improves diagnostic performance in als.</a> Ann Clin Transl Neurol. 6 (12), 2489-2502 (2019).</li>
<li>Iguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+secretion+is+a+key+pathway+for+clearance+of+pathological+tdp-43%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Exosome secretion is a key pathway for clearance of pathological tdp-43.</a> Brain. 139 (Pt 12), 3187-3201 (2016).</li>
<li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+als-ftd-csf+generates+tdp-43+aggregates+in+glioblastoma+cells+through+exosomes+and+tnts-like+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Exposure to als-ftd-csf generates tdp-43 aggregates in glioblastoma cells through exosomes and tnts-like structure.</a> Oncotarget. 6 (27), 24178-24191 (2015).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Autophagy in human diseases.</a> N Engl J Med. 383 (16), 1564-1576 (2020).</li>
<li>Sasaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+spinal+cord+motor+neurons+in+sporadic+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Autophagy in spinal cord motor neurons in sporadic amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 70 (5), 349-359 (2011).</li>
<li>Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Converging+mechanisms+in+als+and+ftd%3A+Disrupted+rna+and+protein+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Converging mechanisms in als and ftd: Disrupted rna and protein homeostasis.</a> Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).</li>
<li>Nguyen, D. K. H., Thombre, R., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+as+a+common+pathway+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Autophagy as a common pathway in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurosci Lett. 697, 34-48 (2019).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+involvement+of+lysosomal+dysfunction+in+pathological+changes+of+the+brain+in+aged+progranulin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Possible involvement of lysosomal dysfunction in pathological changes of the brain in aged progranulin-deficient mice.</a> Acta Neuropathol Commun. 2, 78(2014).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+the+progranulin-driven+autophagy-lysosomal+pathway+mediates+secretion+of+the+nuclear+protein+tdp-43%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of the progranulin-driven autophagy-lysosomal pathway mediates secretion of the nuclear protein tdp-43.</a> J Biol Chem. 299 (11), 105272(2023).</li>
<li>Tanaka, Y., Ito, S., Suzuki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+secretion+via+extracellular+vesicles+is+regulated+by+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy+Rep%22%5BJournal%5D)">TDP-43 secretion via extracellular vesicles is regulated by macroautophagy.</a> Autophagy Rep. 3 (1), (2024).</li>
<li>Ratajczak, M., Ratajczak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+microvesicles%2Fexosomes%3A+discovery%2C+disbelief%2C+acceptance%2C+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Extracellular microvesicles/exosomes: discovery, disbelief, acceptance, and the future.</a> Leukemia. 34 (12), 3126-3135 (2020).</li>
<li>Tanaka, Y., Kozuma, L., Hino, H., Takeya, K., Eto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abemaciclib+and+vacuolin-1+decrease+aggregate-prone+tdp-43+accumulation+by+accelerating+autophagic+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Abemaciclib and vacuolin-1 decrease aggregate-prone tdp-43 accumulation by accelerating autophagic flux.</a> Biochem Biophys Rep. 38, 101705(2024).</li>
<li>Dingjan, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+and+phagosomal+snares%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Endosomal and phagosomal snares.</a> Physiol Rev. 98 (3), 1465-1492 (2018).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progranulin+regulates+lysosomal+function+and+biogenesis+through+acidification+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Progranulin regulates lysosomal function and biogenesis through acidification of lysosomes.</a> Hum Mol Genet. 26 (5), 969-988 (2017).</li>
<li>Kanda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+freely+available+easy-to-use+software+%27EZR%27+for+medical+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transpl%22%5BJournal%5D)">Investigation of the freely available easy-to-use software 'EZR' for medical statistics.</a> Bone Marrow Transpl. 48 (3), 452-458 (2013).</li>
<li>Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle-dependent+variations+in+protein+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Cell cycle-dependent variations in protein concentration.</a> Nucleic Acids Res. 38 (8), 2676-2681 (2010).</li>
<li>Plate, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+proteostasis+regulators+that+reprogram+the+ER+to+reduce+extracellular+protein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Small molecule proteostasis regulators that reprogram the ER to reduce extracellular protein aggregation.</a> eLife. 5, e15550(2016).</li>
<li>Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mammalian+autophagy+in+protein+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Jpn+Acad+Ser+B+Phys+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of mammalian autophagy in protein metabolism.</a> Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 83 (2), 39-46 (2007).</li>
<li>Nanayakkara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+lysosome+reformation+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagic lysosome reformation in health and disease.</a> Autophagy. 19 (5), 1378-1395 (2023).</li>
<li>Nozawa, T., Minowa-Nozawa, A., Aikawa, C., Nakagawa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+STX6-VTI1B-VAMP3+complex+facilitates+xenophagy+by+regulating+the+fusion+between+recycling+endosomes+and+autophagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The STX6-VTI1B-VAMP3 complex facilitates xenophagy by regulating the fusion between recycling endosomes and autophagosomes.</a> Autophagy. 13 (1), 57-69 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.25 % טריפסין EDTA</td><td>Fujifilm Wako</td><td>201-16945</td><td></td></tr><tr><td>10 ס"מ צלחת</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>150464</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינור</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L Pipette Tip</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-301</td><td>pipetting</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Nacalai Tesque</td><td>21417-52</td><td>חומר ל תמיסת חיץ דגימה</td></tr><tr><td>3,3'-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride</td><td>Nacalai Tesque</td><td>11009-41</td><td>חומר לתמיסת DAB</td></tr><tr><td>3.5 ס"מ צלחת&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>6 ס"מ צלחת&nbsp;</td><td>TrueLine</td><td>TR4001</td><td></td></tr><tr><td>אמבטיות תרמוסטטיות בלוק אלומיניום (אמבטיות תרמיות יבשות)</td> <td>EYELA</td><td>273860</td><td></td></tr><tr><td>שואב</td><td>SANSYO</td><td>SAP-102</td><td>תמיסת שאיפה</td></tr><tr><td>Avanti JXN-30</td><td>בקמן קולטר</td><td>B34193</td><td></td></tr><tr><td>Bafilomycin A1</td><td>Adipogen</td><td>BVT-0252</td><td></td></tr><tr><td>וקטור נוגדן IgG מצומד ביוטין</td><td> מעבדות&nbsp;</td><td>BA-1000</td><td>נוגדן שני לאימונובלוטינג</td></tr><tr><td>ביוטין מצומד סוס IgG Antibody</td><td>Vector Laboratories&nbsp;</td><td>BA-2000</td><td>נוגדן שני לאימונובלטינג</td></tr><tr><td>חסימה אחת</td><td>נקלאי טסק</td><td>03953-95</td><td>חומר לאימונובלוטינג</td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>נקלאי טסק</td><td>05808-61</td><td>חומר ל תמיסת חיץ דגימה</td></tr><tr><td>סרום</td><td>עגל cytiva</td><td>SH30073.03</td><td></td></tr><tr><td>CanoScan LiDE 220</td><td>Canon</td><td>CSLIDE220</td><td>סורק</td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5702 R</td><td>eppendolf</td><td>5703000039</td><td></td></tr><tr><td>ספירת שקופיות תא כפול</td><td>תא Bio-Rad</td><td>1450015J</td><td>ספירת תאים</td></tr><tr><td>דיגיטלי סוניפייר 450</td><td>ברנסון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>nacalai tasque</td><td>09659-14</td><td>רכב</td></tr><tr><td>DMEM גלוקוז גבוה</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08458-45</td><td>תרבית בינונית</td></tr><tr><td>DMEM ללא פנול אדום</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08489-45</td><td>מדיום תרבית</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Dojindo&nbsp;</td><td>348-01311</td><td>חומר לפתרון A68</td></tr><tr><td>Excel</td><td>מיקרוסופט</td><td>גרסה 16.16.27</td><td>ניתוח סאטיסטי</td></tr><tr><td>EZR</td><td>הפניה מס' 24</td><td>גרסה 1.68</td><td>ניתוח סאטיסטי</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td></td><td>173012 Culture מדיום</td></tr><tr><td>פיג'י</td><td>NIH</td><td></td><td>כלי ניתוח תמונה</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>נקלאי טסק</td><td>09886-05</td><td>חומר ל תמיסת חיץ דגימה</td></tr><tr><td>Hoehst33342</td><td>Dojindo&nbsp;</td><td>H342</td><td></td></tr><tr><td>מי חמצן</td><td>Fujifilm Wako</td><td>080-0186</td><td>חומר לתמיסת DAB</td></tr><tr><td>Kimwipe S-200</td><td>NIPPON PAPER CRECIA</td><td>62011</td><td>ניקוי לנגב</td></tr><tr><td>צינור שמירה נמוך</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-MCT015CLB</td><td>siRNA והעברת DNA</td></tr><tr><td>LSM780 מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עכבר מונוקלונלי Anti-LC3 נוגדן</td><td>MBL</td><td>M186-3</td><td>נוגדן ראשון לאימונובלוטינג</td></tr><tr><td>ניקל (II) כלוריד הקסהידראט</td><td>פוג'יפילם Wako</td><td>149-01041</td><td>חומר לתמיסת DAB</td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine נתרן מלח</td><td>Nacalai Tesque</td><td>20117-12</td><td></td></tr><tr><td>אופטימה XE-90 אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I סרום מופחת</td> בינוני <td>תרמו פישר מדעי</td><td>31985-070</td><td>siRNA וטרנספקציה של DNA</td></tr><tr><td>pEGFP-C1-hAtg13</td><td>Addgene</td><td>22875</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>נקלאי טסק</td><td>26253-84</td><td>תרבית בינונית</td></tr><tr><td>ערכות בדיקת חלבון BCA Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>ארנב פוליקלונלי נוגדן נגד PCNA</td><td>BioAcademia</td><td>70-080</td><td>נוגדן ראשון עבור אימונובלוטינג</td></tr><tr><td>ארנב פוליקלונלי אנטי-סינטקסין 6 נוגדן</td><td>ProteinTech</td><td>10841-1-AP</td><td>נוגדן ראשון לאימונובלוטינג</td></tr><tr><td>ארנב פוליקלונלי אנטי-TSG101 נוגדן</td><td>ProteinTech</td><td>28283-1-AP</td><td>נוגדן ראשון לאימונובלוטינג</td></tr><tr><td>ארנב פוליקלונלי אנטי-ULK1 נוגדן</td><td>ProteinTech</td><td>20986-1-AP</td><td>נוגדן ראשון לאימונובלוטינג</td></tr><tr><td>פוליווינילידן דיפלואוריד ממברנה</td><td>Milliore</td><td>IPVH00010</td><td>חומר לאימונובלטינג</td></tr><tr><td>צוות ליבה של פיתוח</td><td>R</td><td>גרסה 4.4.1</td><td>ניתוח סאטיסטי</td></tr><tr><td>RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778</td><td>siRNA transfection reagent</td></tr><tr><td>siRNA STX6</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HSS115604</td><td>siRNA לטרנספקציה</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>נקלאי טסק</td><td>31320-05</td><td>חומר למאגר Tris ותמיסת A68</td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>פוג'יפילם Wako</td><td>192-13981</td><td>חומר ל תמיסת חיץ דגימה</td></tr><tr><td>SPARK Microplate Reader</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stealth RNAi דופלקסים בקרה שלילית, Med GC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12935300</td><td>siRNA transfection</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fujifilm Wako</td><td>193-00025</td><td>חומר לתמיסת A68</td></tr><tr><td>TC20 מונה תאים אוטומטי עם מדפסת תרמית</td><td>Bio-Rad</td><td>1450109J1</td><td>ספירת תאים</td></tr><tr><td>Thermobath</td><td>TOKYO RIKAKIKAI</td><td>MG-3100</td><td>דגירה</td></tr><tr><td>TransIT-293</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 2700</td><td>מגיב טרנספקציה DNA</td></tr><tr><td>TransIT-LT1</td><td>Mirus Bio</td><td></td><td>MIR2300 מגיב</td></tr> <tr><td>טרנספקציה DNATris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35406-75</td><td>חומר עבור Tris buffer, מאגר דגימה ותמיסת A68</td></tr><tr><td>Trypan Blue Dye 0.40%</td> <td>Bio-Rad</td><td>1450021</td><td>ספירת תאים צינור</td></tr><tr><td>פתוח ברור במיוחד, 16 x 96 מ"מ&nbsp;</td><td>בקמן קולטר</td><td>361706</td> איסוף עבור הצינור האולטרה-שקוף <td>P1 EV</td></tr><tr><td>, 14 x 89 מ"מ</td><td>בקמן קולטר</td><td>344059</td><td>איסוף עבור שבר P2 EV</td></tr><tr><td>Vectastain ABC Standard Kit</td><td>Vector Laboratories&nbsp;</td><td>PK-4000</td><td>immunoblotting</td></tr><tr><td>לשטוף בקבוק</td><td>כמו אחד</td><td>1-4640-02</td><td>כביסה קרום</td></tr><tr><td>&mu;-שקופית 8 היטב</td><td>גבוה ibidi</td><td>80806</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכה של שחרור lc3-ii באמצעות שלפוחיות חוץ-תאיות ביחס להצטברות שלפוחיות חיוביות ל-lc3 תוך תאיות

Evaluation of LC3-II Release via Extracellular Vesicles in Relation to the Accumulation of Intracellular LC3-positive Vesicles

כפי שהוכח במחקרים קודמים, טיפול Baf הגדיל את רמות TSG101 (P1: P &lt; 0.01, P2: P = 0.012, כפי שנקבע על ידי ANOVA דו-כיווני ב- EZR19) ו- LC3-II (P1: P &lt; 0.01, P2: P &lt; 0.01, כפי שנקבע על ידי ANOVA דו-כיווני ב- EZR19) בחלק העשיר ב- EV. יש לציין כי טיפול Baf גם הגביר את רמות STX6 (P1: P &lt; 0.01, P2: P &lt; 0.01, כפי שנקבע על-ידי ANOVA דו-כיווני ב-EZR19) בחלק EV (איור 1A), דבר המצביע על כך ש-STX6 עשוי להיות רכיב של כלי רכב חשמליים. אנטיגן גרעיני תאי מתפשט (PCNA) לא נצפה בחלק EV. אימונובלוטציה של STX6 במקטע התא גילתה שרמות STX6 ירדו בחצי עם הפלת ה-siRNA שלו (איור 1B). הפלת STX6 לא השפיעה על רמות TSG101 בשברים של תאים ושל EV הן בתנאים של כלי רכב והן בתנאים שטופלו ב-BAF (איור 1C). עם זאת, הפלת STX6 הגדילה את רמות LC3-II בחלק התא במצב שטופל ברכב, אך לא במצב שטופל ב-BAF. הפלת STX6 גם הגדילה את רמות LC3-II בחלק החשמלי במצב שטופל ב-BAF (איור 1D). ממצאים אלה מצביעים על כך שהשיטות המשמשות לזיהוי LC3-II בכלי רכב חשמליים על ידי אימונובלוטינג רגישות מספיק, גם אם יעילות ההפלות אינה משמעותית. בנוסף, תוצאות אלה מצביעות על כך ש-STX6 מגדיל את מספר האוטופגוזום התוך-תאי ומגביר את השחרור החוץ-תאי של בועיות הקשורות לאוטופגוזום תחת טיפול Baf.
כדי להמשיך ולחקור אם STX6 משפיע על מספרים אוטופגוזומיים תוך-תאיים ואוטוליזוזומים, אוטופגוזומים וליזוזומים הודגמו באמצעות הסמן האוטופגוזום mCherry-LC3 והסמן הליזוזום LAMP1-GFP. הדמיה קונפוקלית של תאים חיים חשפה בועיות חיוביות ל-GFP ול-mCherry בתאי HeLa המבטאות LAMP1-GFP ו-mCherry-LC3 (איור 2A). אוטוליזוזומים זוהו כשלפוחיות חיוביות ל-GFP ול-mCherry, בעוד שאוטופגוזומים זוהו כשלפוחיות GFP שליליות ו-mCherry-positive. הפלת STX6 הגדילה את מספר האוטופגוזומים והאוטוליזוזומים במצב של טיפול ברכב (איור 2B,C). אולם הפלה של STX6 לא השפיעה על מספרים אוטופגוזומיים ואוטוליזוזום במצב שטופל ב-BAF (איור 2B,C).
כדי לקבוע אם העלייה במספר האוטופגוזום התוך-תאי עקב הפלת STX6 נבעה מהיווצרות אוטופגוזום מוגברת, נבדק היווצרות אומגהזום, תהליך הנדרש ליצירת אוטופגוזום, באמצעות עוצמת האות של סמן האומגה GFP-ATG13. הדמיה קונפוקלית של תאים חיים סיפקה תמונה מורכבת של GFP-ATG13, המעידה על היווצרות אומגה (איור 3A). הפלת STX6 הפחיתה את עוצמת האות GFP-ATG13 (P = 0.023, כפי שנקבע על ידי ANOVA דו-כיווני ב-EZR19). בעוד שהפלה של STX6 לא השפיעה באופן משמעותי על עוצמת האות של GFP-ATG13 בתנאי הטיפול ברכב, היא הפחיתה באופן משמעותי את האות בתנאים שטופלו ב-BAF (איור 3B). באופן קולקטיבי, ממצאים אלה מצביעים על כך שהפלת STX6 מגבירה את שחרורן של בועיות חיוביות LC3-II הקשורות להצטברות שלפוחיות הקשורות לאוטופגוזום.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67385/67385fig01.jpg"> 
איור 1: תוצאות אימונובלוטינג של שברי התא, P1 ו-P2 מתאי HeLa שעברו בקרה או STX6 siRNA תחת טיפול ברכב או Baf. תאי HeLa טופלו ברכב (DMSO) או 100 ננומטר Baf במשך 24 שעות לאחר טרנספקציה עם בקרה או STX6 siRNA. התא, P1 (20,000 × גרם כדור) ו-P2 (110,000 × גרם כדור) בודדו. (A) תמונות אימונובלוטינג מייצגות של כל שבר המציגות STX6, TSG101, LC3 ו-PCNA. (ב-ד) ניתוח דנסיטומטרי עבור (B) STX6, (C) TSG101 ו-(D) LC3-II בוצע מתמונות האימונובלוט. עוצמות האות נורמלו לתאי הבקרה או STX6 siRNA שטופלו ברכב או ב-Baf. תרשימי העמודות מייצגים ערכים ממוצעים ±- S.E.M. (N = 3). * מציין P &lt; 0.05 על ידי מבחן t לא משויך דו-זנבי ב- Excel. קיצורים: STX6 = תחביר 6; Baf = bafilomycin A1; DMSO = dimethyl sulfoxide; TSG101 = גן רגישות לגידול 101; LC3 = חלבונים הקשורים למיקרוטובול 1A/1B שרשרת אור 3B; PCNA = אנטיגן גרעיני תאים מתרבים; S.E.M. = שגיאת תקן של הממוצע. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67385/67385fig02.jpg"> 
איור 2: ניתוח תמונה קונפוקלית של תאי HeLa המבטאים במשותף Lamp1-GFP ו-mCherry-LC3 שעברו בקרה או SIRNA STX6 במצב של טיפול ברכב וב-Baf. (A) תמונות קונפוקליות של תאי HeLa המבטאים ביציבות LAMP1-GFP ו-mCherry-LC3 הודבקו בבקרה או ב-STX6 siRNA במשך 48 שעות, ולאחר מכן נחשפו ל-DMSO או ל-400 ננומטר Baf במשך 4 שעות. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (B,C) כימות של (B) אוטופגוזומים (נקודות שליליות LAMP1-GFP ונקודות חיוביות mCherry-LC3) ו-(C) אוטוליזוזומים (LAMP1-GFP ונקודות חיוביות כפולות mCherry-LC3) בוצע באמצעות תוכנת פיג'י. הנתונים בתרשימי העמודות מוצגים כערכים ממוצעים ±- S.E.M. (N = 3). * מציין P &lt; 0.05, בהתבסס על מבחן t לא משויך דו-זנבי ב- Excel. קיצורים: Lamp1 = חלבון קרום ליזוזומלי 1; LC3 = חלבונים הקשורים למיקרוטובול 1A/1B שרשרת אור 3B; STX6 = תחביר 6; Baf = bafilomycin A1; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; S.E.M. = שגיאת תקן של הממוצע. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67385/67385fig03.jpg"> 
איור 3: הדמיה קונפוקלית של תאי HeLa המבטאים GFP-ATG13, שעברו טרנספורמציה עם בקרה או עם STX6 siRNA, ועברו טיפול ברכב או ב-Baf. (A) תאי HeLa הודבקו בבקרת ביקורת או ב-STX6 siRNA, ולאחר מכן בטרנספקציה pEGFP-C1-hAtg13, וטופלו ב-DMSO או 400 nM Baf במשך 4 שעות. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (B) עוצמות האות היחסיות נקבעו על ידי נרמול האות בכל מצב לזה של תאי ביקורת siRNA שטופלו ב- Baf. גרף העמודות מציג את הנתונים כאמצעי ± S.E.M. (N = 3). * מציין P &lt; 0.05 על-ידי מבחן t דו-זנבי לא משויך ב- Excel. קיצורים: hAtg13 = גן הקשור לאוטופגיה אנושית 13; STX6 = תחביר 6; Baf = bafilomycin A1; DMSO = dimethyl sulfoxide; S.E.M. = שגיאת תקן של הממוצע. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
איור משלים S1: ניתוח אימונובלוט של שברי התא, P1 ו-P2 מתאי HeLa שעברו סינה-רנ"א בקרה וטופלו ב-Baf. תאי HeLa הודבקו ב-siRNA בקרה ונחשפו ל-100 ננומטר Baf במשך 24 שעות. לאחר מכן הוכנו שברים: תא, P1 (20,000 × גרם גלולה) ו-P2 (110,000 × גרם כדור). תמונות אימונובלוט מייצגות של ULK1 ו- PCNA, המציגות את רמותיהם בכל שבר לצורך השוואה. קיצורים: Baf = bafilomycin A1; ULK1 = unc-51 כמו אוטופגיה המפעילה קינאז 1; PCNA = אנטיגן גרעיני תאים מתרבים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385_Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

הערכה של שחרור LC3-II באמצעות שלפוחיות חוץ-תאיות ביחס להצטברות שלפוחיות חיוביות ל-LC3 תוך תאיות

(Macro)autophagy represents a fundamental cellular degradation pathway. In this process, double-membraned vesicles known as autophagosomes engulf ...

evaluation-lc3-ii-release-via-extracellular-vesicles-relation-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

הנה, cytometry זרימת multispectral הדמיה עם תכונה אנליטית שמשווה תמונות פירוט בהיר של 3 סמנים autophagy ו quantifies שיתוף שלהם לוקליזציה, יחד עם ספירת LC3 ספוט, שימש למדוד autophagy באופן אובייקטיבי, כמותי, סטטיסטית וחסכונית.

הערכת השטף autofagic ידי מדידת LC3, p62, ו LAMP1 Co-localization באמצעות multispectral הדמיה cytometry

Mitophagy, התהליך של פינוי נפגע המיטוכונדריה, הוא הכרחי עבור תחזוקה מיטוכונדריאלי הומאוסטזיס ובריאות. מאמר זה מציג חלק mitophagy האחרונה שיטות זיהוי תאים אנושיים, Caenorhabditis elegansועכברים.

במבחנה and In Vivo זיהוי של Mitophagy ב תאים אנושיים, C. Elegansועכברים

מתח osmotic משפיע אקסוציטוזה ואת כמות הנוירוטרנסמיטר שפורסמו במהלך תהליך זה. נדגים כיצד שילוב שיטות אלקטרוכימיות יחד עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של לחץ אוסמוטי חוץ-תאית על פעילות אקסוציטוזה, שלפוחית quantal בגודל כמות הנוירוטרנסמיטר משוחרר במהלך אקסוציטוזה.

ניטור השפעת Osmotic הלחץ על שלפוחית הפרשה, אקסוציטוזה

כאן מתואר פרוטוקול המאומת היטב ופשוט למדידת נפח פעילות פחמיות autophagic בתרבית של תאים. השיטה מבוססת על לכימות שחלקן של לקטט דהידרוגנאז (LDH) בחלקים תא sedimentable, לעומת סה כ רמות LDH הסלולר.

לקטט דהידרוגנאז פחמיות וזמינותו — שיטה פשוטה ואמינה לקביעת נפח פעילות פחמיות Autophagic בתאים בתרבית

הדו ח הנוכחי מדגיש את הדרישות כרונולוגי לחילוץ שלפוחית לפוחית (EV) בידוד מ מיקרוגלייה או דם מקרופאגים. Microglia-EVs נגזר הוערכו כרגולטורים של neurite מוצלח בעוד דם מקרופאג-נגזר EVs נחקרו בשליטה של הפלישה C6 glioma תא ב מבחנה. המטרה היא להבין טוב יותר אלה פונקציות EV כמו מגשרים החיסונית במיקרו סביבות מסוימות.

אפיון של תא החיסון-מסחטות נגזרות ושלפוחיות ולימוד השפעה פונקציונלית על סביבת התא

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לסימון שלטי דם חוץ-תאיים שמקורם בטסיות דם כדי לפקח על נדידתם וקליטתם בגזירי סחוס המשמשים כמודל לדלקת מפרקים ניוונית.

תיוג של שלל חוץ-תאי לניטור הגירה וספיגה של סחוס

שלל חוץ-תאי (EVs) תורמים לביולוגיה תאית ולתקשורת בין-תאית. יש צורך לבדיקות מעשיות כדי לדמיין ולתייג ספיגת EVs על ידי התאים. הפרוטוקול הנוכחי מציע את בדיקת ספיגת EV על ידי שימוש בהדמיית פלואורסצנטיות תלת ממדית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקל, לאחר בידוד EV על ידי מכשיר מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון.

ספיגת ארסיה חוץ-תאית באמצעות ניתוח הדמיית מיקרוסקופ קונפוצלי

AlPcS2a-mediated chromophore-assisted laser inactivation (CALI) הוא כלי רב עוצמה לחקר נזק מרחבי-זמני של שלפוחיות תוך-תאיות (IVs) בתאים חיים.

גישה פוטודינמית לחקר תפקוד קרע שלפוחית תוך תאית

מטרת פרוטוקול זה היא לקבוע רמות אוטופגיות בסרטן הלבלב ובתאי אסינר בלבלב באמצעות אימונופלואורסנציה LC3 וכימות נקודות LC3.

הערכת רמות אוטופגיה בשני מודלים שונים של תאי לבלב באמצעות LC3 immunofluorescence

הפרוטוקול המוצע כולל הנחיות כיצד להימנע מזיהום באנדוטוקסין במהלך בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות מסופרנאטנטים של תרביות תאים, וכיצד להעריך אותן כראוי.

בידוד של תכולת אנדוטוקסין נמוכה שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בשורות תאים סרטניים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למיקרוסקופ אור-אלקטרונים מתאמי אופטימלי על חתך המבוסס על תיוג אנדוגני פלואורסצנטי ככלי לחקר לוקליזציה של חלבונים נדירים ביחס לאולטרה-מבנה תאי. כוחה של גישה זו מודגם על ידי לוקליזציה אולטרה-מבנית של LC3 אנדוגני בתאים מורעבים ללא טיפול Bafilomycin.

לוקליזציה אולטרה-מבנית של LC3 אנדוגני על ידי מיקרוסקופ אור-אלקטרונים קורלטיבי בחתך

חקור את תפקיד האוטופאגיה בשחרור TDP-43 דרך שלפוחיות חוץ-תאיות במחלות נוירודגנרטיביות כמו ALS ו-FTLD-TDP. שיטה זו מסייעת לזהות מטרות טיפוליות חדשות לטיפול במחלות אלו.

הערכה של שחרור LC3-II באמצעות שלפוחיות חוץ-תאיות ביחס להצטברות שלפוחיות חיוביות ל-LC3 תוך תאיות

גלה סרטונים נוספים