הערכה של שחרור LC3-II באמצעות שלפוחיות חוץ-תאיות ביחס להצטברות שלפוחיות חיוביות ל-LC3 תוך תאיות

המחקר שלנו מתמקד במחלות נוירודגנרטיביות מתקדמות המאופיינות בהצטברות של החלבון הגרעיני TDP-43 בציטופלסמה, כגון ALS או FTLD-TDP. אנו שואפים להבין כיצד פתולוגיות TDP-43 מתפשטות במוח באופן דמוי פריון. בעבר מצאנו כי שחרור TDP-43 באמצעות שלפוחיות חוץ-תאיות מתווך על ידי חוסר ויסות של אוטופגיה.

Progranulin של FTLD-TDP מקל על תהליך זה. האתגר הבא הוא להבהיר כיצד אוטופגיה מווסתת את הייצור והשחרור של שלפוחיות חוץ-תאיות המכילות TDP-43, מה שעשוי להוביל לגילוי מטרות טיפוליות ל-ALS או FTLD-TDP. כדי להתחיל, קחו את תאי ההלה בתרבית, ספרו אותם באמצעות מונה תאים, וזרעו פי עשר בחזקת שישה תאים על צלחת של שישה סנטימטרים המכילה מדיום תרבית.

לדגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ולחות מבוקרת למשך 24 שעות. לאחר מכן, הכינו תמיסת siRNA של 20 מיקרומולרית. ערבבו 100 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת ושלושה מיקרוליטרים של siRNA בצינור בעל שימור נמוך כדי להכין תמיסה A.לאחר מכן, ערבבו 100 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת וחמישה מיקרוליטרים של מגיב טרנספקציה בצינור בעל שימור נמוך כדי להכין תמיסה B.לאחר מכן, ערבבו תמיסה A ותמיסה B, ואז דגרו על התערובת בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.

כעת הוסיפו את תערובת תמיסות A ו-B למדיום המשמש לגידול תאי HeLa ודגרו במשך 24 שעות. למחרת, שטפו את התאים עם PBS וחשפו את התאים ל-500 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין ותמיסת EDTA מילימולרית אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ולחות מבוקרת למשך חמש דקות. לאחר מכן, להוסיף 2.5 מיליליטר של המדיום תרבית לתאים באמצעות פיפטה להעביר פסטר עם קצה פיפטה 20 מיקרוליטר מחובר, להכין תרחיף חד תא.

לאחר ספירת התאים, זרעו אחד פי עשרה בחזקת שישה תאים על צלחת של עשרה סנטימטרים ודגרו, כפי שהודגם קודם לכן. בסוף הדגירה, להכין את המדיום תרבית המכיל רכב או 100 nanomolar bafilomycin A1. לאחר מכן לחשוף את התאים למדיום המכיל רכב או 100 nanomolar bafilomycin A1 ולדגור במשך 24 שעות. למחרת, אספו את כל מדיום התרבות מהצלחת של 10 סנטימטרים.

העבר את המדיום שנאסף לתוך צינור 15 מיליליטר וצנטריפוגה אותו ב 3, 000 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר פסולת התא. כדי לבודד את מקטע השלפוחית החוץ תאי P1, העבר את הסופרנאטנט לאחר צנטריפוגה ב -3, 000 G לתוך צינור צנטריפוגה. צנטריפוגה הצינור ב 20, 000 G בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.

לבידוד של חלק שלפוחית חוץ תאי P2, להעביר את supernatant לאחר צנטריפוגה ב 20, 000 G לתוך צינור אולטרה צנטריפוגה. צנטריפוגה אותו ב 110, 000 G בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר ניגוב הלחות העודפת בתוך הצינור באמצעות מגבון מעבדה, יש להשהות מחדש את הכדורים הנותרים בצינור הצנטריפוגה ב-50 מיקרוליטר של חיץ דגימה דו-פעמי כדי להכין את מקטע השלפוחית החוץ-תאי P1.

לאחר מכן הסר את supernatant על ידי decanting. נגבו את עודפי הלחות בתוך הצינור עם מגבון מעבדה והשהו מחדש את הכדוריות הנותרות בצינור האולטרה-צנטריפוגה ב-50 מיקרוליטר של חיץ דגימה דו-פעמי כדי להכין את מקטע השלפוחית החוץ-תאית P2. יש לדגור על שברי שלפוחית חוץ-תאיים P1 ו-P2 בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס על בלוק חום למשך 10 דקות.

לאחר העברת מדיום התרבית מצלחת 10 ס"מ לתוך צינור 15 מיליליטר, לשטוף את התאים בצלחת 10 ס"מ עם PBS. לאחר מכן חשפו את התאים לשני מיליליטר של 0.25% טריפסין ותמיסת EDTA מילימולרית אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ולחות מבוקרת למשך חמש דקות. הוסף שמונה מיליליטר של מצע גידול לתאים.

בעזרת פיפטת העברת פסטר עם קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר מחובר, פיפטה את התאים להכנת תרחיף חד תאי. מעבירים את מתלה התא לצינור של 15 מיליליטר וצנטריפוגות אותו ב -1, 000 G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן הסר את הסופרנאטנט באמצעות אספירטור.

הוסף PBS לגלולת התא והצנטריפוגה ב -1, 000 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסרת PBS, סוניק את גלולת התא במיליליטר אחד של חיץ A68 המכיל 1% סרקוזיל. מערבבים 300 מיקרוליטר של התא ליזט עם 100 מיקרוליטר של מאגר דגימה ארבע פעמים.

לדגור על התערובת ב 100 מעלות צלזיוס על בלוק חום במשך 10 דקות כדי להכין את חלק התא.