תיוג סופי פלואורסצנטי ואנקפסולציה של רנ"א ארוך למיקרוסקופ FRET-TIRF בעל מולקולה אחת
18 באוקטובר 2024
מאמר זה מתאר את התיוג הכפול של רנ"א ארוך בעמדות טרמיני ואת אימוביליזציה של פני השטח שלהם באמצעות אנקפסולציה בשלפוחיות פוספוליפידים עבור יישומי מיקרוסקופיה FRET TIRF של מולקולה יחידה. שילוב טכניקות אלה מאפשר הדמיה מדויקת וניתוח של דינמיקת RNA ברמת המולקולה הבודדת.
המחקר שלנו מתמקד בדינמיקה של רנ"א פעיל קטליטי וכיצד דינמיקות אלה משתנות בתנאים סביבתיים שונים. אנו משתמשים ב-FRET של מולקולה אחת כדי לחקור את ההשפעה של גורמים כגון קווי אמצע חד-ערכיים ודו-ערכיים, חלבוני מלווה וסוכני צפיפות על דינמיקת הרנ"א. שילוב מדויק של פלואורופורים של תורם ומקבל מבלי לשבש את מבנה הרנ"א ותפקודו הוא מאתגר.
בנוסף, מעקב אחר קיפול של RNA דינמי גדול הוא קשה. עם זאת, פרוטוקול התיוג והאנקפסולציה שנקבע מאפשר לנו לעקוב אחר דינמיקת הקיפול של הרנ"א הפונקציונלי לאורך זמן. הפרוטוקול שלנו נותן מענה לאתגר של צפייה ב-RNA גדול ופעיל קטליטית בזמן אמת ובתנאים ניאופיזיולוגיים.
על ידי תיוג קוולנטי ועטיפת הרנ"א והבועיות, אשר לאחר מכן משותקות על פני השטח, אנו יכולים לנטר את תפקוד הרנ"א באמצעות TIRF בעל מולקולה יחידה. אנו מתמקדים בתיוג FRET קוולנטי של RNA קטליטי ארוך ובמיוחד אינטרונים מקבוצה II. זהו אתגר בשל מורכבותם המבנית.
כאשר אנו עטופים בשלפוחיות, אנו זוכים לשמור את הרנ"א בתוך שדה האוונסנטי עבור מיקרוסקופ TIRF, ובכל זאת הרנ"א יכול לצוף בחופשיות. בדרך זו, smFRET יכול לחשוף את ההתנהגות הדינמית של RNA ללא הפרעה. נמשיך לנסות להבין כיצד הטבע באמת עובד, תוך התמקדות ביחסי מבנה-פונקציה ובדינמיקה של ריבוזומים, ריבומתגים ורנ"א רגולטורי אחר תוך שימוש בגישה רב-טכנית.
לכן, המעבר לחקירות בתנאים פיזיולוגיים ותאיים יהיה דגש מרכזי בעבודתנו בעתיד. כדי להתחיל, aliquot RNA של עניין, שיש 50 עד 75 מיקרוגרם של RNA לכל צינור ב 55 מיקרוליטר של מים מזוקקים כפול, ולאחר מכן להוסיף 45 מיקרוליטר של EDC / NHS נתרן אצטט pH 6 תערובת RNA. דוגרים על התערובת במשך ארבע שעות ב-25 מעלות צלזיוס תוך כדי ניעור ב-500 סל"ד.
לאחר הדגירה, להשהות מחדש את גלולת RNA מופעל ב 95 מיקרוליטר של 100 מילימולרי MOPS חיץ pH 7.5. לאחר מכן הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של אמין ציאנין-3 סולפוני דו-מילימולרי לרנ"א המופעל, ודגרו בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות ב-500 סל"ד כדי להצמיד את הפלואורופור לפוספט 5-פריים המופעל. למחרת, להוסיף 200 מיקרוליטר של מים מזוקקים פעמיים כדי לשפר את ההפרדה.
לאחר מכן לטהר את 5-פריים פוספט מסומן RNA על ידי משקעים אתנול. לאחר הטיהור, להשעות מחדש את הרנ"א המסומן ב 100 מיקרוליטר של 100 מילימולר tris HCl, ולדגור במשך שעתיים ב 25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן כדי להסיר את הצבעים החופשיים, לשטוף את ה- RNA שכותרתו במים מזוקקים כפול עם סינון צנטריפוגלי.
עבור תיוג דו-סופי, aliquot את 5-prime end-labeled RNA, שיש כ 50 עד 75 מיקרוגרם של RNA לכל צינור ב 90 מיקרוליטר של פתרון. הוסף חמישה מיקרוליטרים של חוצץ נתרן אצטט טוחנת אחת pH 5.5. לאחר מכן להוסיף ארבעה מיקרוליטר של 500 מילימולר מוכן טרי נתרן metaperiodate תמיסת מניות.
לתיוג יחיד של 3 פריים, הוסיפו שמונה מיקרוליטרים של תמיסת מלאי מטפריודטים. לאחר דגירה על התמיסות בחושך במשך שעתיים, פיפטה 30 מיקרוליטר של 50% גליצרול כדי לעצור את התגובה. לאחר 30 דקות של דגירה, להוסיף 400 מיקרוליטר של אתנול קר כקרח נתרן אצטט תערובת משקעים.
להשהות מחדש את גלולת RNA מחומצן ב 95 מיקרוליטר של 50 מילימולר נתרן אצטט חיץ pH שש. לטהר את הרנ"א בעל הסימון הכפול על ידי משקעי אתנול וסינון צנטריפוגלי, כפי שהודגם בעבר. יש להצדיע לרנ"א המטוהר במים מזוקקים כפול.
השווה חזותית את צבעי הסופרנאטנט והגלולה המתקבלים לאחר כל שלב. חשב את הרנ"א והצמיד את ריכוזי הצבע על ספקטרופוטומטר נראה UV. אלקטרופורזה בג'ל פלואורסצנטי אישרה את התיוג היחיד והכפול המוצלח של RNA, כפי שמוצג על ידי החיבור של הרנ"א עם הפלואורופורים.
יעילות FRET עלתה בנוכחות יוני מתכת, דבר המעיד על קיפול RNA, מה שהוביל לירידה בפליטת התורם ולעלייה בפליטת הקבלים. כדי להכין תא מיקרופלואידי, השתמש במקדח יהלום כדי לקדוח ארבעה חורים בשקופיות הקוורץ כדי ליצור שני ערוצים. מניחים את מגלשות הקוורץ הקדוחות ומספר הכיסויים בערך כפול לתוך צנצנת זכוכית עם כיסוי.
יש לסובב את המגלשות והכיסויים במים מזוקקים פעמיים למשך חמש דקות. לאחר מכן, העבירו את הצנצנת לתמיסת ניקוי כלי זכוכית במעבדה 10% למשך 30 דקות בחום של 50 מעלות. לאחר שטיפת הצנצנת במים מזוקקים כפול, יש להסוניק בתמיסת אשלגן הידרוקסיד טוחנת אחת למשך 30 דקות ולהשאיר בתמיסה למשך הלילה.
לאחר שטיפה חוזרת ונשנית עם מים מזוקקים, יבשו את המגלשות והכיסויים באמצעות זרימת גז חנקן. טפלו במגלשות ובכיסויים המיובשים עם שואב פלזמה חמצן למשך 30 דקות. הניחו את המגלשות והכיסויים הנקיים בצנצנת צביעה של קופלין המכילה תמיסת אתנול בבדיקת AP 3% Sonicate למשך דקה ולאחר מכן דגרו במשך 30 דקות.
שטפו את המגלשות והכיסויים שלוש פעמים כל אחת באתנול מוחלט ובמים בזיקוק כפול, ולאחר מכן יבשו אותן תחת זרימת גז חנקן. לאחר מכן, הכינו קופסה לחה על ידי מילוי קופסת קצה פיפט ריקה באמצע הדרך במים מזוקקים כפול. מקם את המגלשות בתוך הקופסה כשהצד לטיפול פונה כלפי מעלה.
הוסף טיפות של 30 מיקרוליטר של תערובת bPEG/mPEG טרייה למרכז השקופית כדי לכסות את שני הערוצים. מכסים את הטיפה בכיסוי נקי וסוגרים את הקופסה הלחה. לדגור על הקופסה למשך הלילה בחושך עבור PEGylation.
למחרת, שטפו את המגלשות הפסיביות והביוטיניליות של PEG וכיסויים במים מזוקקים פעמיים והתבוננו בשינוי בהידרופוביות של המשטחים המטופלים. הצמידו את המדבקה הדו-צדדית לשקופית, וודאו שהמדבקה מכסה את אזור העניין. לאחר מכן הניחו בזהירות את הכיסוי על גבי השקופית, ויישרו את משטחי ה-PEGylated כך שיעמדו זה מול זה.
מעבירים את התא המורכב לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר, וממלאים את הצינור בגז חנקן. כדי להתחיל, השתמש במחט סטרילית כדי לדחוף חור מבפנים החוצה במכסה של צינור סטרילי נקי של שני מיליליטר. הוסף 109 מיקרוליטר של תערובת bPE-DMPC לתוך הצינור.
הניחו מחיצת תא קרטון מקופסת אחסון מיקרו-צינורית לתוך בקבוק שלנק 500 מיליליטר כדי לשמש כמחזיק צינור. בעזרת פינצטה ארוכה, מניחים בזהירות את הצינורות המכילים את תערובת השומנים לתוך מחזיק הצינור. יש לאדות את הכלורופורם תחת זרימה נמוכה של גז חנקן למשך הלילה.
לאחר קבלת שכבת השומנים המיובשת, לאטום את הצינורות עם parafilm כדי לכסות את החורים. הרכיבו את המכבש באמצעות קרום פוליקרבונט 100 ננומטר ודיסק ניקוז פוליאסטר 10 מ"מ. אזנו את המזרק והקרומים עם חיץ נגד מצמוץ.
לאחר ערבוב RNA בעל תווית כפולה עם חיץ אנטי-מצמוץ, יש ללחח את עוגת השומנים בתערובת חיץ אנטי-מצמוץ RNA בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. נערו במשך חמש דקות ב-1, 400 סל"ד, ולאחר מכן 15 דקות ב-700 סל"ד. צנטריפוגות את התערובת במשך שתי דקות ב 13, 000 גרם, ומדללים את supernatant עם 250 מיקרוליטר של חיץ נגד מצמוץ.
מלאו את המזרק בתרחיף השומנים של ה-RNA, והפעילו 35 פעמים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס על בלוק חימום כדי לתמצת את ה-RNA בעל התווית הכפולה בשלפוחיות פוספוליפידים בקוטר 100 ננומטר. שטפו את התא פעמיים עם 200 מיקרוליטר של חיץ סטנדרטי פי 5 בטמפרטורת החדר. ממלאים את התא עם 50 מיקרוליטר של 20 מיקרוליטר לכל מיליליטר תמיסת סטרפטווידין, ודגרים במשך חמש דקות.
לאחר מכן שטפו את התא עם 200 מיקרוליטר של חיץ סטנדרטי ו -100 מיקרוליטר של חיץ נגד מצמוץ. מוסיפים 75 מיקרוליטר של השעיית שלפוחית ודגרים במשך 10 דקות עבור immobilization של RNA עטוף על פני השטח. לאחר אימוביליזציה, לשטוף את החדר עם 200 מיקרוליטר של חיץ הדמיה מוכן טרי.
לקבלת נתונים, הרכיבו את התא במיקרוסקופ TIRF ורכשו נתוני smFRET עם עירור לייזר לסירוגין. הדמיית FRET של מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופ TIRF עקבה אחר מולקולות RNA בודדות וזיהתה שינויים בזמן אמת ביעילות FER. עקבות דינמיים של מולקולה אחת הראו תנודות אנטי-מתואמות בין אותות התורם והמקבל, מה שמצביע על שינויים מאשרים ב-RNA.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר סימון דו-צבעי של מולקולות RNA ארוכות בקצותיהן וקיבוע שלהן על פני שטח באמצעות כלילה בתוך שלפוחיות פוספוליפידיות, עבור יישומי מיקרוסקופיית TIRF FRET של מולקולה בודדת. שילוב של טכניקות אלו מאפשר ויזואליזציה וניתוח מדויקים של דינמיקת RNA ברמה של מולקולה בודדת.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביוכימיה
- ביולוגיה מולקולרית
רקע
- הבנת הדינמיקה של RNA היא קריטית להבהרת תפקידיהם הפונקציונליים.
- שיטת Single-molecule FRET מספקת תובנות לגבי קיפול ואינטראקציות של RNA.
- טכניקות סימון וכלילה הן חיוניות לחקר של RNA גדולים.
- גורמים סביבתיים יכולים להשפיע באופן משמעותי על התנהגות ה-RNA.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול לסימון דו-צבעי של RNA ארוכים.
- מתן אפשרות לצפייה בזמן אמת בדינמיקה של RNA באמצעות מיקרוסקופיית TIRF.
- חקירת ההשפעות של גורמים שונים על קיפול ותפקוד של RNA.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- סימון קוולנטי של RNA באמצעות פלואורופורים.
- כלילה של RNA בשקיקים פוספוליפידיים.
- קיבוע לפני השטח עבור מיקרוסקופיית TIRF של מולקולה בודדת.
- אלקטרופורזה של ג'ל פלואורסצנטי כדי לאשר את הצלחת הסימון.
תוצאות עיקריות
- הושגה סימון דו-צבעי מוצלח של RNA ארוך.
- נצפתה עלייה ביעילות ה-FRET בנוכחות יוני מתכת, דבר המעיד על קיפול ה-RNA.
- שיטת הכלילה אפשרה ניטור יעיל של דינמיקת ה-RNA.
- תצפיות בזמן אמת סיפקו תובנות לגבי התנהגות ה-RNA בתנאים פיזיולוגיים.
מסקנות
- הפרוטוקול שפותח מקל על חקר של RNAs גדולים ודינמיים.
- FRET של מולקולה בודדת הוא כלי רב-עוצמה לחקר דינמיקה של RNA.
- מחקרים עתידיים יתמקדו בקשרי מבנה-תפקוד של RNAs שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג הניהולי
סימון פלואורסצנטי ישיר של שני הקצוות וכליאה של RNA ארוכים בתוך וזיקולות מאפשרים ניטור ברזולוציה גבוהה ובזמן אמת של דינמיקה קונפורמציונית של RNA ברמת המולקולה הבודדת. יכולת זו היא קריטית להפחתת סיכונים בהשערות מכניסטיות ולאימות של מטרות RNA פונקציונליות בשלבי הגילוי המוקדמים. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי בצינורות גילוי תרופות המכוונים ל-RNA, על ידי אספקת תוצאות כמותיות ורלוונטיות פיזיולוגית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר תצפית ישירה על קיפול RNA ושינויים קונפורמציוניים תחת תנאים מבוקרים.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטיים על ידי חשיפת קשרי מבנה-תפקוד ב-RNAs רגולטוריים ופעילים קטליטית.
- מסייע בתיקוף תפקודי של מטרות עבור מיני RNA מורכבים, כולל אינטרונים מקבוצה II וריבוסוויצ'ים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק זרימת עבודה סטנדרטית לסימון קוולנטי של קצוות RNA מסוגים שונים באמצעות ריאגנטים זמינים מסחרית.
- מספק תוצרי FRET כמותיים וניתנים לשחזור, המתאימים לסריקות המשך ולמחקרים השוואתיים.
- מאפשר הכנה של מערכות וסיקולות של RNA בודד עבור בדיקות מולקולה בודדת בעלות תוכן גבוה ואמינות מרבית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם אסטרטגיות של ביומרקרים תרגומיים על ידי תמיכה במחקרים תחת תנאים תאיים וקרובים לפיזיולוגיים.
- שומר על רצף החל משלב בירור המנגנונים של שלב הגילוי ועד לאימות פרה-קליני של תפקוד ה-RNA.
- מפחית סיכון ביולוגי על ידי אספקת ראיות דינמיות בזמן אמת להתנהגות ה-RNA הרלוונטית למודלים של מחלות.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline) וזרימה
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לבחינה מונחית-היפותזה של מטרות RNA, פיתוח בדיקות כמותיות ומחקרים מכניסטיים בעלי רלוונטיות תרגומית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערת האפס ובבירור נתיבים עבור מנגנונים המתווכים על ידי RNA.
- סריקה: מספקת מדידות FRET כמותיות וניתנות לשחזור לצורך ניתוח השוואתי של מצבי RNA.
- אנליטיקה: מספקת רזולוציה של מולקולה בודדת ומקריאות דינמיות לצורך ניתוח סטטיסטי חסון.
- מחקר תרגומי: מקלה על ביצוע מחקרים בתנאים המדמים סביבות פיזיולוגיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פרוטוקול סימון וכמיסה בעל התאמה רחבה למגוון מטרות RNA.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות RNA.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של סימון וכמיסה של RNA עבור תהליכי עבודה ניתנים להרחבה ולשחזור.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go ואת הקצאת ההון באמצעות אספקת נתונים כמותיים בזמן אמת.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תוכניות המכוונות ל-RNA בהתאם לסיכון, על בסיס ראיות תפקודיות דינמיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בכימיה של RNA, סימון פלואורסצנטי ומיקרוסקופיה של מולקולה בודדת.
- מחייב גישה למיקרוסקופיית TIRF ותשתית אנליטית לרכישה וניתוח של נתוני FRET.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי סימון, הכמסה ודימות.
- ניתן להתאמה למגוון גדלים ורצפים של RNA, אך ייתכן שיידרש אופטימיזציה עבור RNA בעל מבנה מורכב.
- תלוי בזמינות של ריאגנטים בדרגת טוהר גבוהה ובקרת איכות קפדנית בכל שלב בתהליך העבודה.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:59
Site‐Specific Dual‐End Labeling of RNA with Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Fluorophores for Structural and Functional Studies
5:25
Preparation and Surface Treatment of Microfluidic Chambers for Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy
7:54
Phospholipid Vesicle Encapsulation for RNA Delivery and Single‐Molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET)‐Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy
