צביעה חיה/מתת לכימות תאים ברי קיימא אך לא ניתנים לתרבית בחיידקים הגורמים לפצעים שטופלו בדבש מנוקה

מטרת פרויקט המחקר הזה היא לחקור את ההשפעה של דבש מנוקה על הפיזיולוגיה של החיידקים. מחקרים שנערכו לאחרונה סיפקו תובנות נוספות לגבי ההשפעות האנטי-בקטריאליות של דבש מנוקה על הפיזיולוגיה של החיידקים. הממצאים הראשוניים שלנו מצביעים על כך שחיידקי דבש מנוקה נכנסים למצב תרדמה עמיד לאנטיביוטיקה, בר-קיימא אך לא תרבית, אך במידה פחותה מאלה שטופלו באנטיביוטיקה קונבנציונלית.

בהתבסס על הניסויים שלנו, יהיה מעניין להשוות את פרופילי הביטוי של דבש מאנוקה לבין VBNCs המושרים על ידי אנטיביוטיקה קונבנציונלית. כדי להתחיל, קח את הבקבוקונים המכילים זני חיידקים קפואים. פתחו כל אחד מהם ברצף והשתמשו במקל סטרילי כדי לגרד כמות קטנה של חיידקים קפואים על צלחת האגר Luria-Bertani או LB המסומנת כראוי.

החזירו את מכסה הבקבוקון והכניסו אותו במהירות למקפיא. דגרו על תרביות החיידקים למשך 18 עד 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. למחרת, השתמש בפיפטה סרולוגית כדי להעביר שני מיליליטר של מרק LB לשתי מבחנות סטריליות.

עקר את לולאת החיסון בלהבת מבער הבונסן לאחר מכן העבירו רבע לולאה של חיידקים מצלחת אגר LB למבחנה המסומנת כראוי המכילה מרק LB. דגרו את המבחנה בתנאים אירוביים בחממה רועדת בכ-250 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס למשך 18 עד 24 שעות.

להגדרת דבש מאנוקה וטיפולים אנטיביוטיים בחיידקים, הוסיפו 10 מיקרוליטר של תרבית חיידקים ל-10 מיליליטר של מרק מולר הינטון כדי לקבל דילול של 1:1,000 של תרבית החיידקים, שיש בה כ-10 עד המושבה השישית היוצרות יחידות למיליליטר. השתמשו בתרביות המדוללות כדי להכין שלוש דגימות לכל זן חיידקים, בקרה לא מטופלת, דגימה שטופלה בדבש מאנוקה ודגימה שטופלה באנטיביוטיקה. הוסיפו את דבש מנוקה ואת האנטיביוטיקה לשפופרות המתאימות.

העבר 0.1 מיליליטר ו-0.5 מיליליטר מהדגימה הלא מטופלת לצינורות מיקרו צנטריפוגה סטריליים לספירת הצלחות הקיימא וצביעה חיה/מתה עבור ה-T שווה לאפס דגימות. לאחר מכן דגרו על דגימות הביקורת הלא מטופלות, דבש מאנוקה שטופל ואנטיביוטיקה בתנאים אירוביים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד ב-250 סל"ד למשך 24 שעות. הכן דילול סדרתי פי עשרה של ה-T שווה לאפס דגימה לא מטופלת במרק LB כדי לקבל מספר תאים שניתן לספור עבור ספירת הצלחות הקיימת.

מורחים 50 מיקרוליטר מכל דגימה מדוללת על מחצית צלחת אגר LB. דגרו את צלחות האגר בתנאים אירוביים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. למחרת, הסר את צלחות האגר LB מהחממה.

זהה את צלחת הדילול המכילה כ-25 עד 150 מושבות וספור את המספר המדויק של המושבות. השתמש בנוסחת היחידה היוצרת מושבה כדי לקבוע את מספר התאים הניתנים לתרבות למיליליטר. ביום השלישי, הוסף 0.5 מיליליטר של 0.85% נתרן כלורי ל-0.5 מיליליטר T שווה לאפס דגימת בקרת צביעה חיה/מתה לא מטופלת.

שלב 1.5 מיקרוליטר של SYTO 9 ו -1.5 מיקרוליטר של יודיד פרופידיום לדגימה. לאחר מכן מוסיפים שלושה מיקרוליטר מהתערובת לכל דגימה. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 21 מעלות צלזיוס בחושך למשך 15 דקות.

העבירו שישה מיקרוליטרים מהדגימה המוכתמת והמעורבת בעדינות להמוציטומטר חד פעמי וצפו במיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות מסנן פלואורסצאין איזותיוציאנט או FITC ועדשת אובייקטיבית פי 40. צלם תמונה המציגה הן את קווי הרשת של ההמוציטומטר והן את התאים הירוקים. ספרו את התאים הירוקים בשישה שדות לכל דגימה, ושימו לב לממדי הרשת כדי לחשב את מספר התאים הירוקים לכל אמצעי אחסון.

לבסוף, חשב את מספר התאים ברי קיימא אך לא ניתנים לתרבות על ידי הפחתת מספר התאים הניתנים לתרבות למיליליטר המתקבל באמצעות ספירת הצלחות הקיימא ממספר התאים בני קיימא למיליליטר המתקבל באמצעות צביעה חיה/מתה. ביום הרביעי, לאחר הוצאת תרביות חיידקים לא מטופלות, דבש מאנוקה שטופל ואנטיביוטיקה מהאינקובטור, אוספים 0.1 מיליליטר ו-0.5 מיליליטר מכל דגימה לתוך צינורות מיקרו צנטריפוגות לספירת צלחות בת קיימא וצביעה חיה/מתה. איור זה מציג את מספר התאים הניתנים לתרבית ובני קיימא שנקבעו באמצעות ספירת הצלחות הקיימא והצביעה החיה/מתה עבור תרביות S.aureus ו-P.aeruginosa.

התוצאות מראות כי מספר התאים הניתנים לתרבית שזוהו בתרביות שלא טופלו ובדבש מנוקה שלא טופלו לא היה שונה באופן משמעותי. בתרביות S.aureus שטופלו בטוברמיצין היו פחות תאים ניתנים לתרבית מאשר תאים ברי קיימא, אך הבדל זה לא היה משמעותי. רק מרופנם שטופל ב-P.aeruginosa הראה ירידה מובהקת סטטיסטית בתאים הניתנים לתרבית בהשוואה לתאים ברי קיימא.