Name: הערכת תנועתיות עצבי לתאי גזע באמצעות התקן הגל מבוסס agarose Microfluidic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-11T02:20:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: חקור את השפעת EGF על תנועתיות תאי גזע עצביים באמצעות התקן מיקרו-זורמי מבוסס אגרוז. השיטה מאפשרת יצירת מדרג כימי ליניארי סטטי לניטור מיגרציה תאית במיקרוסקופ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי משרד של מדינת ניו יורק למדע, טכנולוגיה ומחקר אקדמי (NYSTAR) (בצורה של מרכז עבור טכנולוגיה מתקדמת מענק), וכן על ידי מענקים ממרכז Nanobiotechnology (NBTC), תוכנית STC הלאומי קרן המדע על פי הסכם מס &#39;ECS-9876771, והמוח האמריקאי גידול עורכי הדין בניו יורק, האקדמיה לרפואה (ג&#39;ב).

נוהל ציפוי שקופיות עם פיברונקטין לפני ההרכבה של המכשיר microfluidic, לעקר שקופיות הזכוכית עם פיברונקטין. המעיל שקופיות biohood לשמור על סטריליות. יישר spacer סטרילי PDMS בשולי השקופית ולסמן את הצד שהוא פונה כלפי מעלה עם סמן קבע. פיפטה 1 מ&quot;ל של פתרון מיקרוגרם / 5 מ&quot;ל של פיברונקטין (Sigma) בתוך spacer PDMS על מכלול שקופיות הזכוכית. השאירו את השקופיות ללא הפרעה במשך שעה, ואז להתייבש לחלוטין באמצעות אקדח 2 N. השקופיות ניתן לאחסן 4 o C עבור ניסויים מאוחר יותר. הרכבת מכשיר פרוטוקול כולו הרכבה המכשיר נעשית biohood בתנאים סטריליים, באמצעות הפעולות הבאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את המאסטר סיליקון עם microchannels בדוגמת עליה על ידי מנגב אותו עם אתנול 70% וייבוש עם האקדח N 2. מניחים spacer סטרילי PDMS גובה 1 מ&quot;מ באמצעות מלקחיים סביב התכונות הקלה של המאסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו את הג&#39;ל agarose השתמשו במכשיר על ידי במשקל 0.3 גרם של אבקת agarose (פישר סיינטיפיק) ו 10 מ&quot;ל CO 2-מדיה עצמאית (Invitrogen) בכוס 50 מ&quot;ל. מערבבים את התערובת עם מרית חום במיקרוגל למשך 20 שניות על HIGH. אם גרגרי שלא נמס נוכחים, חום את התערובת למשך 10 שניות מערבולת את התערובת החמה להיפטר הגרגרים האחרון שנותר. חזור על התהליך עם זמן חימום של 8 שניות, ולאחר מכן 5 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות לשפוך את הפתרון agarose על המאסטר סיליקון מוקף spacer PDMS ומיד לכסות את התערובת agarose עם שקופיות זכוכית סטרילית. החלת לחץ מתמיד, עדין לשקופית כ -2 דקות על מנת להבטיח כי agarose יהיה ג&#39;ל כדי באותו גובה 1 מ&quot;מ קבוע כשומר PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ג&#39;לים agarose, לקלף agarose בדוגמת ג&#39;ל עם spacer PDMS מן האדון סיליקון להעביר שקופיות הזכוכית פיברונקטין מצופה microchannels בתוך הג&#39;ל agarose מול שקופית. השתמש קצה המזרק 16 מד לנקב חורים לתוך האזורים מאגר של microchannels עבור כניסת כניסות ו לשקע. הוסף 500 μl של CO 2-מדיה עצמאית על agarose בדוגמת ג&#39;ל בשקופית כדי למנוע התייבשות של microchannels. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את סעפת אקריליק בשימוש במכשיר עם אתנול 70% ולשטוף עם מים די. יישר את החורים הרבים עם החורים אגרוף לתוך הג&#39;ל agarose עם microchannels. ואז, ליישר את סעפת עם הג&#39;ל, spacer PDMS, ואת החלק פיברונקטין עם מסגרת המתכת של המכשיר. המקום ברגים לתוך המכשיר והדק עד כדי התנגדות באמצעות מברג. הדבר נעשה על מנת להבטיח כי המכשיר אינו מעל התהדקו עד כדי לעוות את microchannels ב agarose. הדקו את הברגים כדי השעון כדי להבטיח את הג&#39;ל בתוך המכשיר אינו משמרת. בדוק את המכשיר עבור דליפות חסימות microchannels שימוש במזרק 1ml. מזרק מצויד בצינור Tygon עם קצה ג&#39;ל טעינת פיפטה בסוף בצינור להזריק 2-CO מדיה עצמאית ב microchannels. Microchannel נחשבת נוצר בהצלחה כאשר התקשורת היא נצפתה רק יציאה משקע של microchannel כאשר התקשורת מוזרק לתוך מפרצון המקביל. עכשיו, המכשיר מוכן לשימוש. </li></ol> הכנה מתזמן את התאים למכשיר כאשר התאים מגיעים 70% (צפיפות התאים סביב 100,000 תאים / מ&quot;ל) confluency, הם מוכנים להיות seeded לתוך המכשיר. נושא התאים לשני DPBS (Invitrogen) שוטף. הוסף 200 μl של טריפסין-EDTA (Invitrogen) לנתק את התאים. העברת התאים צינור המכיל 15 מ&quot;ל צנטריפוגות 5 מ&quot;ל של התקשורת M2 המכילה סרום להשבית טריפסין. Centrifuged התקשורת צמיחה עם התאים על 1000 סל&quot;ד במשך 5 דקות. Aspirated את supernatant ו resuspend גלולה של תאים 5 מ&quot;ל של DPBS. צנטריפוגה התאים DPBS שוב באותם תנאים. Aspirated את supernatant שוב, resuspend גלולה של תא 500 μl של CO 2-מדיה עצמאית. זרעים ההשעיה וכתוצאה מכך התאים למרכז microchannel של המכשיר באמצעות זרימת הכבידה מונע. מוסיפים את כניסת ו לשקע של מרכז microchannel עם 60 μl של השעיה על התא 20 μl של המדיום 2-CO עצמאיים, בהתאמה. שים לב מרכז microchannel תחת מיקרוסקופ brightfield לחפש הידבקות התא. התאים בדרך כלל לדבוק אחרי 10 דקות. אחרי התאים להיצמד לתחתית הערוץ בצפיפות ראויה, pipeted את ההשעיה תא שנותרו כניסת ואת התקשורת לשקע. מקום 60 μl של CO2 עצמאית התקשורת וגם לשקע כניסת הערוץ למרכז. המקום משתרע על פני ה PDMSדואר כניסת מרכז לשקע כדי למזער את התאדות של התקשורת מערוץ מרכז. הדמיה התאים למכשיר לפני ההרכבה של המכשיר, החוט צינורות peristaltic סטרילית דרך תחנת מזג האוויר של המיקרוסקופ (אולימפוס X81) ולהתחבר עם המשאבה peristaltic (ווטסון, מרלו 205U/CA). פלאש PBS דרך צינורות בשיעור של 4 סל&quot;ד. לאחר ההרכבה של המכשיר, להכין ריכוזים מתאימים של גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) (Sigma) פתרונות של 2-CO מדיה עצמאית ב 15 מבחנות צנטריפוגה מ&quot;ל. וורטקס EGF פתרונות עבור 5 שניות להתחבר עם צינור. חבר את tubings המסומנים ריכוזי EGF המתאים למכשיר. זה לוקח בערך שעה עבור EGF כדי מפוזר על פני הרכס ערוץ ולהקים שיפוע כימי יציב. תוכנת הדמיה, Slidebook, הוא נהג לקחת סדרה של תמונות על כל 10 דקות במשך כ 5 שעות בטווח ניסיונית. השלב xy אוטומטי מתוכנת כך כי שני אזורי משנה (כל אחד עם שטח של x400μm 400μm) של הערוץ אותו מוקד, וכן סך של שלושת הערוצים הם צילמו במרכז בנקודת זמן נתונה. תאים ערוצי מרכז שונים (בדרך כלל 3 בטווח אחד) יש ריכוזים EGF שונים, המסומנים על הצינור. חומרים וציוד שורות תאים: תאים C17.2 NSCs נגזר השכבה החיצונית של המוח הקטן נבטי עכבר הלידה 6, 7. באמצעות קו זה התא, פיתחנו שני האחרים Murine בתאי גזע קווי transfection באמצעות שיטת רטרווירוס. שתי השורות הללו ביציבות התא transfected הם (1) wtEGFR - כי מעל מבטא את EGFR אדם סוג בר, (2) ΔEGFR - כלומר מוטציה EGFR פעיל constitutively. על מנת להקל על הזיהוי, רטרווירוסים לשאת השדרה עם הגן של אינטרסים ואחריו אתר פנימי מחייב ריבוזומלי (IRES) לבין חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). Cell תרבות: C17.2 העכבר NSCs וגירסאות שלהם גדלו צלחת 6-באר M2 מדיה (DMEM (Invitrogen) עם 10% בסרום שור העובר (FBS) (Invitrogen), סוס בסרום 5% (ש&quot;מ) (Invitrogen ), ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (Invitrogen).) תאים נשמרו על 37 מעלות צלזיוס באוויר 80% ו 5% CO 2. המכשיר microfluidic: סעפת פלסטיק, spacer PDMS, ואת מסגרת נירוסטה להחזקת המכשיר במקום. הדמיה מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה (אולימפוס IX-81) משמש, בקשר עם CCD התעצמה המצלמה (אורקה, Hamamatsu). המכשיר microfluidic הוא רכוב על הבמה XYZ אוטומטיות, והשלב מוקפת קאמרית סביבתיים שומרת על טמפרטורה של 37 o C. בדרך כלל יש 3-4 מכשירים על אותו שבב זה יהיה מצולם בנקודת זמן זהה באמצעות הבמה אוטומטיות xyz. שמירה על תזרים המשאבה peristaltic עם 8 קווים מקבילים (ווטסון, מרלו 205U/CA) אוטומטי משמש כדי לשמור על תזרים בכל הכיור ערוצי מקור. <img src="/files/ftp_upload/old/674_2008_9_29_6/674_Figure-01.jpg" alt="איור 1" width="573" height="414" /> איור. 1 תנועתיות של שלושה זנים NSC (הורים, wtEGFR, ו-D-EGFR) בריכוזים שונים EGF כל מסלולי לקוחים מעקב סרט של 5 שעות (למעט wtEGF 100ng/ml, 4hour), וכן את המקור של כל המסלולים היו מיקומו בבית (0,0) לצורך השוואה. <img src="/files/ftp_upload/old/674_2008_9_29_7/674_Figure-02.jpg" alt="איור 2" width="576" height="546" /> איור. 2 מתאם של רמת ביטוי EGFR ו - תנועתיות (א) שתי תמונות של NSCs wtEGF על פני השטח של ערוץ microfluidic עם 100ng/ml EGF. התמונה השמאלית היא תמונה ניאון, והזכות היא תמונה משודרים שדה בהיר. סרגל מידה הוא 100μm, ואת רוחב הערוץ הוא 400 מיקרומטר. תאים מופרדים לשתי האוכלוסיות על ידי בהירות ה-GFP הביעו. תאים בחוגים כחול הם עמומים, ובכך יש רמת ביטוי EGFR פחות; ותאי בחוגים באדום brigher, ובכך יש ביטוי ברמה גבוהה EGFR. (ב) מסלולים של תאים עם רמה נמוכה וגבוהה ביטוי EGFR. מסלולים אלו לקוחים מתוך סרט באורך שעה ארבע.

<ol><li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics%3A+in+search+of+a+killer+application%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics: in search of a killer application.</a> Nature Methods. 4, 665-670 (2007).</li>
<li>Shing-Yi Cheng, S. H., Wassweman, M. ax, Archer, S. hivaun, Shuler, M. ichael L., Wu, M. ingming <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hydrogel-based+microfluidic+device+for+the+studies+of+directed+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Lab-on-a-chip%22%5BJournal%5D)">A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migration.</a> Lab-on-a-chip. 7, 763-769 (2007).</li>
<li>Pedersen, M. W., Tkach, V., Pedersen, N., Berezin, V., Poulsen, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+naturally+occurring+constitutively+active+variant+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+mouse+fibroblasts+increases+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression of a naturally occurring constitutively active variant of the epidermal growth factor receptor in mouse fibroblasts increases motility.</a> Int J Cancer. 108, 643-653 (2004).</li>
<li>Ayuso-Sacido, A., Graham, C., Greenfield, J. P., Boockvar, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+duality+of+EGFR+signaling+and+neural+stem+cell+phenotype%3A+Cell+enhancer+or+cell+transformer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">The duality of EGFR signaling and neural stem cell phenotype: Cell enhancer or cell transformer.</a> Current Stem Cell Research and Therapy. 1, 231-238 (2006).</li>
<li>Eisenbach, M., Constantinou, C., Aloni, H., Shinitzky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repellents+for+Escherichia+coli+operate+neither+by+changing+membrane+fluidity+nor+by+being+sensed+by+periplasmic+receptors+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Repellents for Escherichia coli operate neither by changing membrane fluidity nor by being sensed by periplasmic receptors during chemotaxis.</a> J Bacteriol. 172, 5218-5224 (1990).</li>
<li>Snyder, E. Y., Deitcher, D. L., Walsh, C., Arnold-Aldea, S., Hartwieg, E. A., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+neural+cell+lines+can+engraft+and+participate+in+development+of+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multipotent neural cell lines can engraft and participate in development of mouse cerebellum.</a> Cell. 68, 33-51 (1992).</li>
<li>Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+neural+precursors+can+differentiate+toward+replacement+of+neurons+undergoing+targeted+apoptotic+degeneration+in+adult+mouse+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 11663-11668 (1997).</li>
</ol>

איור. 1 מראה מסלולים של שלושה זנים NSC, התאים הורית, wtEGFR ואת ΔEGFR (שליטה). כל סט של מסלולי התקבלו בסרט 5 שעות ארוכות. עבור תאים הורית, תנועתיות התא הגיע לשיאו כאשר ריכוז EGF היה ~ 10ng/ml; עבור תאים wtEGFR, תנועתיות שיא התא עבר 100ng/ml או לעיל; עבור תאים ΔEGFR, תנועתיות התא היה עצמאי של ריכוז EGF כצפוי. התאים wtEGF עם 100ng/ml היו תאים ניעתי ביותר, הם עברו על 1.5 פעמים מהר יותר מאשר תאים עם ההורים 10ng/ml. זה מצביע על כך (1) על הביטוי של EGFR משפר א...

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>11971-025</td><td></td></tr><tr><td>מדיום ללא תלות ב-CO2</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>18045-088</td><td>מדיום קנייני ללא HEPES המתאים לתמיכה בצמיחת תאים עבור מגוון של שורות תאים אפיתליאליים, פיברובלסטים ותאי לימפה בתנאי אטמוספירה, אינו מכיל L-glutamine</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td>תמיסת סליין עם בופר פוספטים, ללא סידן או מגנזיום</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>מכיל 10,000 יחידות של penicillin (בסיס) ו-10,000 g של streptomycin (בסיס)/ml תוך שימוש ב-penicillin G (מלח נתרן) ו-streptomycin sulfate ב-0.85% סליין</td></tr><tr><td>FBS</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td>סרום עגל עוברי (Fetal Bovine Serum), מאושר (Qualified)</td></tr><tr><td>סרום סוסים</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>16050-130</td><td>סרום סוסים, סרום שנבדק ב-EIA (שלילי)</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td>Fibronectin מפלזמה אנושית, נקרא גם cold insoluble globulin</td></tr><tr><td>EGF</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4127</td><td>גורם גדילה אפיתליאלי (Epidermal Growth Factor) מבלוטת תת-הלסת של עכבר, ליאופיליזד</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>ריאגנט</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1356-500</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכת תנועתיות עצבי לתאי גזע באמצעות התקן הג&#39;ל מבוסס agarose microfluidic

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

בעוד הטכנולוגיה microfluidic הוא להגיע לרמה חדשה של בגרות עבור מבחני macromolecular, מבוססי תאים מבחני נמצאים עדיין בשלב תינוק 1. זהו בעיקר בשל הקושי שבה ניתן ליצור microenvironment תא תואם ויציב באמצעות טכניקות microfabrication קונבנציונאלי וחומרים. אנו לטפל בבעיה זו באמצעות הקדמה של חומר microfabrication רומן, agarose ג&#39;ל, כחומר בסיס עבור המכשיר microfluidic. Agarose ג&#39;ל הוא נזיל מאוד, החדיר את גז וחומרים מזינים הנחוצים להישרדות התא, ובכך חומר אידיאלי עבור מבוססי תאים מבחני. הראינו בעבר כי agarose מכשירים מבוססי ג&#39;ל הצליחו ללמוד נדידת תאים חיידקיים נויטרופילים 2. בדו&quot;ח זה, בשלושה ערוצים מקבילים microfluidic הם בדוגמת בקרום ג&#39;ל agarose בעובי 1 מ&quot;מ בערך. תזרים קבוע עם התקשורת / חיץ נשמרים בשני ערוצי הצד באמצעות משאבת peristaltic. תאים נשמרים בערוץ במרכז לצורך השגחה. מאז מזינים וכימיקלים בערוצים לוואי לשדר כל הזמן מהצד למרכז הערוץ, את הסביבה הכימית של הערוץ במרכז נשלטים בקלות באמצעות זרימת לאורך תעלות הצד. שימוש במכשיר זה, אנו מראים כי תנועת בתאי גזע עצביים ניתן לנטר אופטית בקלות בתנאים כימיים שונים, את תוצאות הניסוי הראו כי ביטוי יתר של קולטני אפידרמיס גורם גדילה (EGFR) משפר את תנועתיות של בתאי גזע עצביים. תנועתיות של בתאי גזע עצביים הוא סמן חשוב להערכת האגרסיביות תאים, ובכך גורם tumorigenic 3. פיענוח המנגנון הבסיסי תנועתיות NSC תניב תובנה הן הפרעות התפתחות סרטן עצביים אל המוח הפלישה בתאי גזע.

אנו מראים כי ביטוי יתר של קולטני אפידרמיס גורם גדילה (EGFR) משפר את תנועתיות של בתאי גזע עצביים (NSCs) באמצעות מכשיר agarose רומן ג&#39;ל microfluidic מבוסס. טכנולוגיה זו ניתן להתאמה בקלות מערכות אחרות תא יונקים שבו מקורות תא נדירים, כגון אדם בתאי גזע עצביים, ועל להסתובב הזמן הוא קריטי.

הערכת תנועתיות עצבי לתאי גזע באמצעות התקן הג&#39;ל מבוסס agarose Microfluidic

בעוד שטכנולוגיית המיקרופלואידיקה מגיעה לרמה חדשה של בשלות עבור בדיקות של מקרו-מולקולות, בדיקות מבוססות תאים נמצאות עדיין בשלב ראשוני1. זהו...

שלום, אני קווין וון. אני סטודנט לתואר שני בהנדסה במעבדת הביו-נוזלים (Biofluids Lab) באוניברסיטת קורנל. והיום אני אדבר על שימוש במכשיר מיקרופלואידי מבוסס agarose כדי לחקור את השפעת EGF (גורם גדילה אפידרמלי) על תאי גזע עצביים של עכברים.המכשיר מורכב בעיקרו משלושה תעלים מיקרופלואידיים, שכל אחד מהם ברוחב 150 מיקרון. ה-EGF מופעל באמצעות משאבה אל אחד התעלים הצדדיים והבופר מופעל אל התעל הצדדי השני. תצורה זו יוצרת למעשה מדרג כימי ליניארי סטטי לרוחב התעל המרכזי.מאחר ש-EGF מדליף בקלות דרך ג'ל האגרו, תאי גזע עצביים נזרעים בתעלת המרכז ומהלך נדידתם מנוטר באמצעות מיקרוסקופ. לפיכך, המכשירים מורכבים בעיקר משכבת פלקסיגלאס עליונה הכוללת את כל פתחי הכניסה והיציאה לחיבור לפביות. מתחתיה נמצאת ממברנת ג'ל אגרו, שבה מוטמעים ארבעה מכשירים תבניתיים.זה מוקף במפריד PDMS, המבטיח עובי קבוע לאורך כל המכשיר. ה-PDMS והג'ל מורכבים על משטח זכוכית, המצופה ב-ect. דבר זה מסייע לתאים להיצמד למשטח הזכוכית.בנוסף, פלטת הפלדה הנירוסטה משמשת להרכבת המכשיר כולו, ואנו מהדקים את המכשיר יחד באמצעות ברגים. שורת התאים מסוג הפרא (wild type) עברה טרנספקציה עם וקטור רטרו-ויראלי לביטוי 과י (overexpression) של קולטן EGF מסוג הפרא, ושורת תאי הדלתה עברה טרנספקציה עם גרסה מוטציה של קולטן EGF המאפשרת לו להיות פעיל באופן קבוע ללא ליגנד EGF. אשמח להתחיל בהסבר על תהליך ההרכבה של המכשיר המיקרו-פלואידי שלנו.ראשית, הצבתי את מחסום ה-PDMS מסביב למבני התבליט של מיקרו-התעלות הסיליקון בתבניות שלנו. כעת, אשקול 0.3 גרם של agros. לאחר מכן, אעלה 10 מיליליטר של מצע גידול שאינו תלוי CO2 ואוסיף אותו ל-agros.אני אבצע פיפטאזה למעלה ולמטה כדי לערבב את אבקת ה-agros עם המצע שאינו תלוי CO2. כעת אנו מוכנים למיקרוגל. כפי שניתן לראות כעת, ה-agros נוזלי, אך נותרו מספר גרגירים.אנסה לסובב את המבחנה כדי להמיס את הגרגיר ולהיפטר מבועות האוויר. כעת אני שופכת את ה-agarose הנוזלי עלून אלמנטי התבליט של תבנית הסיליקון, ואקח זכוכית כיסויה סטרילית ואניח אותה מעל למרווח ה-PDMS. אני מניחה אותה בזווית כדי לנסות לדחוף החוצה את מרבית בועות האוויר מה-agarose gel.הפעלתי לחץ ואמשיך להפעיל לחץ עד שמעטפת ה-agros תתמצק. לאחר דקה עד שתי דקות היא התמצקה. כעת אסיר את עודפי ה-agros מהסלייד.השלב הבא הוא להחליק בעדינות החוצה את תיתור הזכוכית, וניתן להשליך תיתור זכוכית זה. כעת אנסה להעביר בעדינות את תבנית ה-agros לתיתור זכוכית שציפיתי מראש ב-fibronectin. אני משתמש בגיליון פלסטיק סטרילי זה כדי לסייע לי להרים את תבנית ה-agros יחד עם מחסור ה-PDMM MS, ואעביר את תבנית ה-agros כאשר התעלות פונות כלפי מטה לעבר התיתור.כעת, לאחר שהמכשיר מקובע להטיה, אנקב חורים במאגרים הבודדים כדי שהסבב הפלסטי יוכל לגשת לתעלות. אבצע זאת באמצעות מחורר מתכת קטן. כעת סיימנו לנקב חורים במכשיר.אוסיף 500 µL של מצע שאינו תלוי CO2 כדי למנוע התייבשות של המיקרו-ערוצים, ואקפיד להמתין אחת עד שתי דקות. כעת, לאחר אחת עד שתי דקות, אנסה לנקז את עודפי המצע ולאחר מכן איישר את החורים שננקבו בתבנית האגרס עם חורי הכניסה והיציאה של סעפת הפלקסיגלאס. לאחר שהחורים הגיעו ליישור, אלחץ בחוזקה כדי ליצור אטימה טובה.כעת אני מניח את המניפולטור מהפלקסיגלאס מעל התושבתות מפלדת אלחלד, ואסגור בעדינות את המכשיר באמצעות ברגים. אני נזהר מאוד שלא להדק את הברגים יתר על המידה, שכן הדבר ימעך את התעלים, ואני מחזיר את הברגים בסדר עם השעון כדי למנוע את תזוזתו של ג'ל ה-Agarose הפנימי. אני אשאב 1 mL של מדיום ואשתמש במזרק זה כדי לבחון את המכשיר.וכפי שניתן לראות, אני מזריק נוזל לכל מיקרו-תעלה ובודק אם נוזל יוצא מכל פתח יציאה. נכון לעכשיו, הנחתי את המכשיר המורכב בתא הסביבתי של המיקרוסקופ. תא זה נשמר בטמפרטורה של 37 °C, כך שהמכשיר יתחמם ויהיה מוכן לשלב זריעת התאים.וכפי שניתן לראות, כבר השחלתי את שני צינורות משאבת הפריסטלטיקה דרך המערך. כעת אני שוטפת את הצינורות עם PBS כהכנה לניסויים שלנו. עכשיו נבצע את הגדרת הצינורות.אני אשחיל את צינורות משאבת ה-parasol דרך הפקקים שבהם כבר נקבו חורים. לכל צינור יש מספר ספציפי של חריצים, כדי שאוכל לזהות הן את הכניסה והן את היציאה של הצינור. לפיכך, הצינור עם ארבעה חריצים יקבל את ה-10 nanogram per mil.כעת נחבר את הפיתולים של תמיסת ה-EGF למכשיר. אחבר אותם לכל מכשיר בהתאם למספר החריצים שבו, כך שיתאימו לכמות התמיסה שהמכשיר סופג.וכעת אני מחבר את צינור היציאה. אנו משתמשים בצינור tigon שקוף כדי להבטיח שהמדיה אכן זורמת דרך צינור היציאה ושאין חסימות בתעלה. וכעת אני אפעיל את משאבות הפריסטלטיקה.כעת אתחיל בהליך זריעת התאים בערוץ המרכזי. אתחיל בהוצאת עודפי המצע מערוץ החיישן. כעת אוכל לראות את התאים.התאים כבר נמצאים בתרחיף במצע שאינו תלוי CO2. הזרקתי 60 מיקרוליטר בפתח הכניסה של התעלה המרכזית והזרקתי 20 µL בפתח היציאה. בתקווה שהתאים ישקעו באמצעות זרימה מונחית כבידה.אחזור על הליך זה עבור שני הערוצים הרגישים האחרים, וכעת נבחן זאת תחת המיקרוסקופ כדי לראות אם השבצת התאים הצליחה. כעת התאים נצמדו לשקף הזכוכית ובתוך מספר דקות הם יתחילו להתפשט ולהשיג את המורפולוגיה הייחודית שלהם. היום כיסינו את הרכבת המכשיר עצמו, את הכנת הריאגנטים ואת טכניקות המיקרוסקופ שבהן אני משתמש כדי לדגום את נדידת התאים בתוך המכשיר.לסיכום, אנו מקווים כי למכשיר זה יהיה יישום רחב הרבה יותר, ובמיוחד במסגרת קלינית. לכן, באיור 1, מוצגים בציר האופקי המסלולים של תאי C 17.2 ובציר האנכי ריכוזים עולים של EGF.הוא מראה את מסלולי התנועה של זני התאים השונים של C 17.2 שבהם השתמשנו בניסויינו עם אותה ריכוז EGF. נתוני תאי האב מראים כי קיים שיא בניידות במדרג ריכוזי EGF של 10 nanogram per mil, מה שמעיד על כך שהקולטנים הגיעו לרוויה של ליגנד בריכוז EGF גבוה יותר. ונתוני הטיפוס הפראי מראים כי קיימת עלייה בניידות בריכוז של 100 nanogram per mil של EGF.דבר זה מעיד על כך שהקולטנים אינם מגיעים לרוויה בריכוזי EGF גבוהים יותר. זאת מכיוון שהם תוכננו כדי לבטא באופן יתר את קולטן ה-EGF. לבסוף, הנתונים של קו התאים דלתא מעידים כי ניידות התאים היא בקירוב בלתי תלויה בריכוז ה-EGF.דבר זה צפוי, כיוון שקולטני ה-EGF המוטגים תוכננו להיות מופעלים ללא תלות בנוכחות EGF.

assessing-neural-stem-cell-motility-using-an-agarose-gel-based

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מכשיר microfluidic מידור לחקר נדידת תאי גזע סרטני מתואר. פלטפורמה חדשנית זו יוצרת microenvironment סלולרי קיימא ומאפשרת הדמיה מיקרוסקופית של תנועת תאים חייה. מאוד ניעתי תאים סרטניים מבודדים ללמוד מנגנונים מולקולריים של חדירה אגרסיבית, שעלולים לגרום לטיפולים יעילים יותר בעתיד.

הערכה של נדידת תאי גזע סרטני באמצעות מכשירי microfluidic מידור והדמית תא חייה

בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד לבנות תאים מותאמים אישית המאפשרים יישום של שדה חשמלי בזרם ישר כדי לאפשר הדמית זמן לשגות של המוח מבוגר נגזר טרנסלוקציה תא מבשר העצבית במהלך galvanotaxis.

Assay Galvanotaxis לניתוח של קינטיקס נדידת תאים העצביים המבשר בשדה חשמלי נוכחי לשימוש חיצוני ישיר

מקור: שיידוויילר, ד., ואחרים. שילוב מכשירים נוזליים עם מיקרוסקופיה וציטומטריית זרימה לחקר הובלה מיקרוביאלית במדיה נקבובית בקנה מידה מרחבי. J. Vis. Exp. (2020).הסרטון הזה מדגים את השימוש במכשיר מיקרופלואידי לכימות תנועתיות חיידקית באמצעות מטריצה נקבובית המורכבת מעמודים מסודרים באקראי. חיידקים מסומנים פלואורסצנטית מוכנסים למכשיר, מצולמים במיקרוסקופיה כשהם נעים דרך המטריצה הנקבובית אל ערוץ התצפית, ומנותחים ליצירת עקומת פריצת דרך (BTC).

הערכת תנועתיות חיידקית באמצעות מכשיר מיקרופלואידי

סרטון זה מדגים את מבחן ההגירה של תאי נוירוספירה עצביים מקדימים – בדיקה במבחנה לחקר התגובה הנודדת של תאים מקדימים עצביים מהנוירוספרה – באמצעות אנליזה מיקרוסקופית.

NPC Neurosphere Assay: בדיקה חוץ גופית כדי להעריך את התגובה הנודדת של תאים מבשרי עצבים מן הנוירוספרה

אנו מציגים vivo לשעבר assay נדידת תאים המאפשר כימות מדויק של פוטנציאל נדידת תאי רכס העצבי enteric בנוכחות של גורמי גדילה שונים.

Assay נדידת תאים כמותיות לMurine אבות עצביים enteric

כאן, אנו מתארים טכניקות הדמיה לחיות תאים למדוד באופן כמותי את ההעברה ואת הפלישה בתאי גזע המוח גידול גליובלסטומה לאורך זמן, תחת תנאים מרובים של הטיפול.

מבחני הדמיה לחיות תאים מחקר המוח גליובלסטומה גידול תאי גזע ההעברה, הפלישה

כוחות מכניים חשובים לשליטה בהעברת תאים. פרוטוקול זה מדגים את השימוש של הידרוג'לים אלסטיים שיכולים להיות מעוותים באמצעות מיקרופיפטה זכוכית מיקרומניפולציה כדי לגרות תאים עם מעבר קשיות מקומי כדי לעורר שינויים במבנה התא והגירה.

מערכת בודדת של תא להערכת בקרה מכנית של התנועה הסלולרית ואירועי איתות קשורים

אנו מציגים שלושה פשוטים מחוץ לגוף הרחב, שיטת ההגירה למרחקים ארוכים, שיטת ההגירה של תרבות השיתוף, והטיפול בטיפול בכימותרפיה-הערכת באופן קולקטיבי את התפקודים של תאי גזע אנושיים שמקורם בתאים אנדותקיים וה אינטראקציה עם האינטרנוירונים הבינכולינרגיות.

הגירה, כימותרפיה-אטרקציה, ושיתוף התרבות Assays בשביל הגזע האנושי תאים הנגזרת האנדותל והנוירונים

אנו מתארים שיטה ליצירת יחידות מוטוריות אנושיות במכשירים מיקרופלואידיים זמינים מסחרית על ידי שיתוף פולחן נוירונים מוטוריים המושרה תאי גזע פלוריפוטנטים עם מיוטיובים ראשוניים אנושיים וכתוצאה מכך היווצרות של צמתים עצביים שריריים פעילים מבחינה תפקודית.

ייצור יחידות מוטוריות אנושיות עם צמתים נוירו-שריריים פונקציונליים במכשירים מיקרופלואידיים

מחקר זה מציג את בדיקת נדידת פצעי השריטה הדו-ממדית (2D) ואת בדיקת הנבטת הספרואידים התלת-ממדית (3D), יחד עם שיטות הניתוח שלהם במורד הזרם, כולל מיצוי RNA ואימונוציטוכימיה, כבדיקות מתאימות לחקר אנגיוגנזה במבחנה.

חקירת אנגיוגנזה ברמה תפקודית ומולקולרית על ידי מינוף בדיקת נדידת פצע השריטה ובדיקת הנבטת הספרואיד

פרוטוקול להערכה כמותית של נדידת תאים תלת מימדיים בתוך ולתוך הממשק של הידרוג'לים גרגירים מוצג כאן.

כימות נדידת תאים תלת מימדית בתוך ובתוך ביו-חומרים הידרוג'ל גרגירים

חקור את השפעת EGF על תנועתיות תאי גזע עצביים באמצעות התקן מיקרו-זורמי מבוסס אגרוז. השיטה מאפשרת יצירת מדרג כימי ליניארי סטטי לניטור מיגרציה תאית במיקרוסקופ.

הערכת תנועתיות עצבי לתאי גזע באמצעות התקן הג'ל מבוסס agarose Microfluidic

גלה סרטונים נוספים