הערכת תנועתיות עצבי לתאי גזע באמצעות התקן הג'ל מבוסס agarose Microfluidic
11 בפברואר 2008
אנו מראים כי ביטוי יתר של קולטני אפידרמיס גורם גדילה (EGFR) משפר את תנועתיות של בתאי גזע עצביים (NSCs) באמצעות מכשיר agarose רומן ג'ל microfluidic מבוסס. טכנולוגיה זו ניתן להתאמה בקלות מערכות אחרות תא יונקים שבו מקורות תא נדירים, כגון אדם בתאי גזע עצביים, ועל להסתובב הזמן הוא קריטי.
היי, אני קווין זכה. אני סטודנטית לתואר שני בהנדסה במעבדת הביו-פלואידים באוניברסיטת קורנל. והיום אני הולך לדבר על שימוש במכשיר מיקרופלואידית מבוסס אגרוס כדי לחקור את ההשפעה של גורם גדילה אפידרמלי EGF על תאי גזע עצביים של מורין.
המכשיר מורכב בעצם משלוש תעלות מיקרופלואידיות, כל אחת ברוחב 150 מיקרון. ה-EGF נשאב לאחת מתעלות הצד והמאגר נשאב לתעלה הצדדית השנייה. זה בעצם מגדיר שיפוע כימי ליניארי סטטי על פני הערוץ המרכזי.
מכיוון שפיזור ה-EGF מתפזר בקלות דרך האגרו ג'ל, תאי הגזע של הנוירונים נזרעים בתעלה המרכזית ומעקב אחר התקדמות נדידתם באמצעות מיקרוסקופ. אז המכשירים מורכבים בעצם משכבה עליונה של פרספקס שיש בה את כל הכניסות והיציאות לחיבור לצינורות. ומתחתיו יש קרום אגרו ג'ל, שיש בו ארבעה מכשירי תבנית.
זה מוקף במרווח PDMS, מה שמבטיח שיש לנו עובי קבוע בכל המכשיר הכולל. ה-PDMS והג'ל מורכבים על שקופית זכוכית, המצופה ב-ect. זה עוזר לתאים להיצמד לשקופית הזכוכית.
בנוסף, לוחית הנירוסטה משמשת להרכבת המכשיר כולו ואנו סם סנדוויץ' את המכשיר יחד עם ברגים. קו התאים מסוג הבר עבר טרנספטציה עם וקטור רטרו-וירוס כדי לבטא יתר על המידה את קולטן ה-EGF מסוג הפראי, וקו תאי הדלתא עבר טרנספטציה עם גרסה מוטנטית של קולטן ה-EGF המאפשרת לו להיות פעיל באופן מכונן ללא ליגנד EGF. אוקיי, אז אני אתחיל בהסבר על תהליך ההרכבה של מכשיר המיקרו נוזלי שלנו.
אז מיקמתי תחילה את מרווח ה-PDMS סביב תכונות ההקלה של תעלות המיקרו סיליקון במאסטרים שלנו. אז עכשיו אני הולך לשקול 0.3 גרם אגרוס. אז עכשיו אני הולך להעלות 10 מיל של מדיה עצמאית של CO2 ולהוסיף את זה לאגרוס.
ואני הולך לזרום למעלה ולמטה כדי לערבב את אבקת הארוס עם המדיה העצמאית של CO2. עכשיו אנחנו מוכנים למיקרוגל. כפי שאתה יכול לראות כעת, האגרוס נוזלי כעת, אך עדיין נותרו כמה גרגירים.
אנסה לסובב את זה כדי להמיס את הגרגיר ולהיפטר מבועות האוויר. אז אני שופך את האגרוס המותך על תכונות התבליט של מאסטר הסיליקון ועכשיו אקח מגלשת זכוכית סטרילית ואניח אותה מעל מרווח ה-PDMS. והנחתי אותו בזווית כדי לנסות להוציא החוצה את רוב בועות האוויר בג'ל האגרו.
ואני הפעלתי לחץ ואמשיך להפעיל לחץ עד שקליפת האגרוס תתמצק. אז אחרי דקה או שתיים הוא התמצק. עכשיו אסיר את עודפי האגרוס מהשקופית.
השלב הבא הוא להחליק בעדינות את מגלשת הזכוכית וניתן להשליך את מגלשת הזכוכית הזו. עכשיו אני אנסה להעביר בעדינות את התבנית ארוס למגלשת זכוכית שציפיתי בעבר בפיברונקטין. אני בעצם משתמש ביריעת הפלסטיק הסטרילית הזו כדי לעזור לי להרים את אגרוס התבנית עם מרווח PDMM MS ואני אעביר את אגרוס התבנית עם התעלות כלפי מטה לכיוון המגלשה.
כעת, כשזה נמצא היטב על מגלשת הזכוכית, אנקב חורים במאגרים הבודדים כך שלסעפת הפלסטיק תהיה גישה לערוצים. אני אעשה זאת באמצעות מנקב חורים מתכתי קטן. עכשיו סיימנו לנקב חורים במכשיר.
אוסיף 500 מיקרוליטר של מדיה עצמאית CO2 כדי למנוע התייבשות של תעלות המיקרו וכעת אתן לזה לשבת דקה עד שתיים. אוקיי, לאחר דקה עד שתיים, אנסה לנקז את המדיה העודפת ועכשיו איישר את החורים שנכנסו לתוך אגרוס התבנית עם חורי הכניסה והיציאה של סעפת הפרספקס. וברגע שהחורים מיושרים, אני לוחץ בחוזקה כדי ליצור אטימה יפה.
עכשיו אני מניח את סעפת הפרספקס מעל תושבות הנירוסטה ועכשיו אני סנדוויץ' בעדינות את המכשיר יחד באמצעות ברגים. אני נזהר מאוד לא להדק יתר על המידה את הברגים כי זה ימעך את התעלות ואני מכניס את הברגים פנימה בכיוון השעון כדי למנוע מבפנים ג'ל אגרוס לחרוץ. אני הולך לצייר מיליון מדיה ואני אשתמש במזרק הזה כדי לבדוק את המכשיר.
וכפי שאתם יכולים לראות, אני מזריק נוזל לכל מיקרו-ערוץ ומחפש נוזל שייצא מכל שקע. אז כרגע הנחתי את המכשיר המורכב בתא הסביבתי של המיקרוסקופ. זה נשמר על 37 מעלות צלזיוס, כך שזה יחמם את המכשיר ויכין אותו לזמן שבו נצטרך לזרוע את התאים.
וכפי שאתה יכול לראות, כבר השחלתי את השניים, צינור משאבת השמשייה דרך ההתקנה. וכרגע אני שוטף את הצינורות עם PBS כהכנה לניסויים שלנו. אז עכשיו אנחנו הולכים להקים את הצינור.
אני הולך להשחיל את צינור משאבת השמשייה דרך המכסים עם חורים שכבר נוקבו בהם. ולכל צינור יש מספר מסוים של חריצים כדי שאוכל לזהות גם את הכניסה וגם את היציאה של הצינור. אז הצינור עם ארבע חריצים עליו יקבל את ה-10 ננוגרם למיל.
פתרון EGF יחבר כעת את הצינור למכשיר. אז אני אחבר אותו לכל מכשיר לפי כמה חריצים יש לו. אז זה תואם את הפתרון שהוא לוקח.
ועכשיו אני מחבר את צינור היציאה. אנו משתמשים בצינורות טיגון שקופים כדי להבטיח שהמדיה אכן זורמת דרך צינורות היציאה ואין סתימות בערוץ. ועכשיו אתחיל את משאבות השמשיות.
אז עכשיו אתחיל בהליך לזריעת התאים בערוץ המרכזי. אתחיל בהוצאת המדיה העודפת בערוץ החיישן. אז עכשיו אני אראה את התאים.
התאים כבר נמצאים בתרחיף במדיה עצמאית CO2. ואני נמכרתי, ישבתי 60 בכניסה של התעלה המרכזית וישבתי 20 מיקרוליטר בשקע. ואני מקווה שהתאים יושבים על ידי זרימה מונעת על ידי כוח הכבידה.
ואני אחזור על ההליך הזה עבור שני הערוצים הרגישים האחרים וכעת נצפה בזה תחת המיקרוסקופ כדי לראות אם הישיבה בתא הייתה מוצלחת. אז עכשיו התאים נדבקו למגלשת הזכוכית ותוך מספר דקות הם יתחילו להתפשט ולקבל את המורפולוגיה הייחודית שלהם. אז היום כיסינו את הרכבת המכשיר עצמו, הכנת הריאגנטים וטכניקות המיקרוסקופ בהן אני משתמש כדי לדמות את נדידת התאים בתוך המכשיר.
לסיכום, אנו מקווים שלמכשיר זה תהיה התפטרות רחבה בהרבה, במיוחד במסגרת הקלינית. אז דמיין אחד אופקית. הוא מראה את המסלולים של תאי C 17.2 והגדלת ריכוזי ה-EGF אנכית.
הוא מראה את המסלולים של הזנים השונים של תאי C 17.2 שבהם השתמשנו בניסויים שלנו עם אותו ריכוז EGF. נתוני תאי ההורים מראים שיש שיא בתנועתיות בשיפוע ריכוז ה-EGF של 10 ננוגרם למיל, מה שמצביע על כך שהקולטנים הפכו רוויים בליגנד בריכוז EGF גבוה יותר. ונתונים מסוג פרא מראים שיש עלייה בתנועתיות בריכוז של מאה ננוגרם למיל או EGF.
זה מצביע על כך שהקולטנים אינם רוויים בריכוזי EGF גבוהים יותר. זה הגיוני מכיוון שהם תוכננו לבטא יתר על המידה את קולטן ה-EGF. לבסוף, נתוני קו תאי הדלתא מצביעים על כך שתנועתיות התאים אינה תלויה בערך בריכוז ה-EGF.
זה צפוי גם מכיוון שקולטני ה-EGF המוטנטיים תוכננו להיות מופעלים ללא תלות בנוכחות EGF.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מדגים כי ביטוי יתר של קולטני גורם גדילה אפידרמליים (EGFR) מגביר את הניידות של תאי גזע עצביים (NSCs) באמצעות התקן מיקרופלואידי חדש המבוסס על ג'ל אגרוז. טכנולוגיה זו ניתנת להתאמה למערכות תאים יונקיים אחרות שבהן מקורות התאים מוגבלים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מיקרופלואידיקה
רקע
- גורם הגדילה האפידרמלי (EGF) משפיע על התנהגות תאים.
- תאי גזע עצביים (NSCs) חיוניים עבור התחדשות עצבית.
- התקנים מיקרופלואידיים מאפשרים בקרה מדויקת על סביבות תאיות.
- הבנת הניידות של תאי גזע עצביים (NSC) יכולה לסייע ברפואה רגנרטיבית.
מטרת המחקר
- לבדיקת השפעת EGF על ניידות של NSC.
- לפיתוח התקן מיקרופלואידי לחקר תגובות תאיות.
- לספק תובנות לגבי התנהגות של NSC בסביבה מבוקרת.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פיתוח של התקן מיקרופלואידי מבוסס ג'ל אגרוז.
- יצירה של מדרג כימי ליניארי סטטי של EGF.
- תצפית על ניידות של NSC בתגובה לחשיפה ל-EGF.
- שימוש בערוצים מיקרופלואידיים לבקרה מדויקת של נוזלים.
תוצאות עיקריות
- ביטוי יתר של EGFR מגביר משמעותית את ניידות תאי ה-NSC.
- ההתקן המיקרופלואידי יוצר מדרגי ריכוז כימיים ביעילות.
- התוצאות מצביעות על יישומים פוטנציאליים בטיפולים רגנרטיביים.
- ניתן להתאים את הממצאים לתאי גזע עצביים אנושיים.
מסקנות
- EGF ממלא תפקיד קריטי בניידות של NSC.
- המכשיר שפותח הוא כלי בעל ערך למחקרים תאיים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתרחב לסוגי תאים ולתנאים אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניידות של תאי גזע עצביים משמשת כביו-סמן ניבוי לפוטנציאל טומוריגני ולהפרעות התפתחותיות, מה שהופך את הערכתם הכמותית לקריטית בשלבים מוקדמים של תיקוף מטרות (target validation). פלטפורמה מיקרופלואידית המבוססת על ג'ל אגרוז מאפשרת ביצוע בדיקות ניידות הניתנות לשחזור ובשליטה במדרוג (gradient), התומכות בהפחתת סיכונים מכניסטיים של מודולטורים של נתיב ה-EGFR. גישה זו מגבירה את הביטחון בזיהוי מובילים (leads) על ידי קישור בין ביטוי יתר של קולטן לתוצאות פנוטיפיות תפקודיות במערכת רלוונטית למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של ניידות תלוית EGFR כמדד תפקודי למעורבות המטרה בתאי גזע עצביים.
- ערך תפעולי: מספק מיקרו-סביבה מבוקרת לבידוד השפעות האיתות של EGFR ממשתנים מתערבים במבחני ניידות.
- ערך חיזוי: תומך בסינון פנוטיפי של מודולטורים של EGFR על ידי כימות שינויים בניידות תחת מדרגי ריכוז כימיים מוגדרים.
סקר ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצרת מדידות כמותיות ואופטיות של ניידות, המתאימות לניתוח עתיר-תוכן (high-content analysis) ולסריקת תרכובות.
- שחזוריות: ייצור ג'ל אגרוז מבטיח גיאומטריה עקבית של התעלות ותכונות דיפוזיה דומות בין חזרות.
- סקביליות: תבנית של מספר התקנים בממברנת ג'ל אחת מאפשרת בדיקה מקבילה של מספר תנאים או שורות תאים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: קושר את ניידות תאי NSC להערכת גורמים תומאי גידול, ובכך תומך במודלים פרה-קליניים של פלישת תאי גזע של סרטן המוח.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מבהיר האם ביטוי יתר של EGFR מניע ניידות ללא תלות בליגנד, ובכך מסייע בבחירת מטרה לאסטרטגיות עיכוב.
- המשכיות תרגומית: מאפשר השוואה בין וריאנטים של EGFR מסוג wild-type, כאלה עם ביטוי יתר, ווריאנטים פעילים באופן קוסטטיטיבי, כדי לחזות פרופילים של תגובה קלינית.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
המכשיר משתלב ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות לגבי מטרות ועד לאופטימיזציה של מובילים, ומספק נתונים פנוטיפיים מבוססי ניידות המשמשים לקבלת החלטות המשך/עצירה (go/no-go) לפני השקעה בשלב הפרה-קליני.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבחינת השערות לגבי תפקידו של EGFR בניידות של NSC באמצעות בקרה מדויקת של מפל (gradient) ודימוי בזמן אמת.
- סריקה: מספק פלטי ניידות כמותיים וסטנדרטיים המאפשרים השוואה בין תרכובות המווסתות את EGFR או בין וריאנטים גנטיים.
- אנליטיקה: מייצר מדדים מבוססי מסלול (trajectory) המקלים על השוואה סטטיסטית של הניידות בין תנאים וקווי תאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאי ניידות in vitro לרלוונטיות פתופיזיולוגית במודלים של התפתחות עצבית וסרטן המוח.
- שימוש חוזר ארגוני: פלטפורמת ג'ל האגרוז ניתנת להתאמה לסוגי תאי יונקים אחרים, ובכך תומכת בסטנדרטיזציה בין פרויקטים שונים בבדיקות מבוססות ניידות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית באיתות של EGFR על ידי קישור מצב הרצפטור לפנוטיפים תפקודיים של ניידות.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזור של הבדיקה באמצעות ייצור ג'ל סטנדרטי ויצירת גרדיאנט באמצעות פרפוזיה בערוץ צדדי.
- ערך אסטרטגי: משפר את תיעדוף המטרה על ידי אספקת תיקוף תפקודי מעבר לבדיקות קישור או ביטוי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קידום מותאם-סיכון של מועמדים המכוונים ל-EGFR בהתבסס על הפחתת סיכונים פנוטיפית מונעת-ניידות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהרכבה מיקרופלואידית, טיפול בג'ל אגרוז ודימוי תאים חיים תחת פרפוזיה מבוקרת.
- תלוי בגישה למשאבות פרפוזיה, תאי סביבה ומיקרוסקופים הפוכים למעקב אחרי ניידות בשיטת time-lapse.
- מחייב סטנדרטיזציה של צפיפות זריעת התאים ועובי הג'ל כדי להבטיח מדרגי דיפוזיה והיצמדות הניתנים לשחזור.
- כולל שיקולי התאמה עבור סוגי תאים שונים בהתבסס על תכונות ההיצמדות ומאפייני הניידות על משטחים מצופים בפיברונקטין.
- מוגבל על ידי הנגישות האופטית של מטריצת הג'ל ואוטופלואורסצנציה פוטנציאלית המשפיעה על קריאות מסוימות המבוססות על פלואורסצנציה.
