ניתוח ציטומטריית מסה של תגובות חיסוניות מערכתיות ומקומיות בקרצינומה של הכבד
25 באפריל 2025
פרוטוקול זה מתאר שיטת ניתוח מקיפה של ציטומטריית מסה (ציטומטריה לפי זמן טיסה [CyTOF]) להערכת תגובות חיסוניות מערכתיות ומקומיות בקרצינומה של הכבד (HCC). הגישה שואפת לספק תובנות לגבי הנוף החיסוני של HCC, ולהציע הבנה מעמיקה יותר של המיקרו-סביבה של הגידול והמנגנונים החיסוניים הנלווים.
ציטומטריית מסה מאפשרת לנו לנתח תגובות חיסוניות שיטתיות ומקומיות בקרצינומה של הכבד. על ידי פרופיל תאי חיסון ברמת התא הבודד, אנו מזהים תת-קבוצות ייחודיות ואת המצבים התפקודיים הקשורים להתקדמות הגידול, ומציעים תובנות לגבי מנגנוני התחמקות חיסונית והיעדים הטיפוליים הפוטנציאליים לטיפולים מותאמים אישית. הפרוטוקול שלנו משתמש בציטומטריית מסה כדי לנתח למעלה מ-14 סמנים בו זמנית ברמת התא הבודד, תוך הימנעות מחפיפה ספקטרלית הנראית בציטומטריית זרימה מסורתית. זה כרוך בזיהוי מדויק של אוכלוסיות תאים אמיתיות, ומספק נתונים ממדיים גבוהים לפרופיל חיסוני מפורט וגילוי הסמנים הביולוגיים.
[קריין] כדי להתחיל, יש להפשיר את התא החד-גרעיני של הדם ההיקפי הקפוא ואת תרחיפי תאי ההפטוקרצינומה. לאחר התאוששות התאים, השעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של PBS ללא סידן ומגנזיום. מוסיפים ציספלטין לריכוז סופי של 0.5 מיקרומולר, מערבבים היטב ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. כדי לעצור את התגובה, צנטריפוגה את הצינורות ב -500 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט, ואז הוסיפו מיליליטר אחד של מאגר צביעת תאים לכל צינור. לאחר הצנטריפוגה שוב, השליכו בזהירות את הסופרנטנט. כדי לבצע חסימת קולטן FC, ראשית, הכינו תערובת בלוק של 50 מיקרוליטר לכל דגימה, שלבו 48 מיקרוליטר של מאגר צביעת תאים עם שני מיקרוליטר של תמיסת חסימת FC. השעו מחדש את כדור התא בתערובת הבלוק ודגרו. לאחר מכן, הוסף 1.1 מיקרוליטר מכל נוגדן לדגימה לתוך צינור מסומן כדי להכין את תערובת הנוגדנים של חלבון הממברנה. הרכיבו את הנפח ל-55 מיקרוליטר עם מאגר מכתים תאים. העבירו 50 מיקרוליטר מתערובת הנוגדנים המוכנה לכל צינור דגימה, והביאו את הנפח הכולל ל-100 מיקרוליטר. לאחר מכן מערבבים בעדינות את הדגימות לערבוב לפני הדגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. הוסף מיליליטר אחד של מאגר צביעת תאים לכל צינור דגימה. צנטריפוגה בחום של 500 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר והשליכו את הסופרנטנט. לאחר הכביסה האחרונה, מערבל בקצרה את הנוזל שנותר עם כדור התא כדי להשעות היטב את התאים. לצביעת חלבון גרעין, הוסף 500 מיקרוליטר מתמיסת הקיבוע המעורבת לתאים המרחפים. מערבבים בעדינות את הדגימות לפני הדגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה בחום של 500 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר והשליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן, פיפטה 1000 מיקרוליטר של מאגר חדירות לכל צינור כדי לשטוף את התאים. ואז צנטריפוגה את הצינורות ב 1000 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הוסף 50 מיקרוליטר מתערובת הנוגדנים לכל שפופרת לאחר השלכת הסופרנטנט. פיפטה בעדינות את התאים כדי לערבב היטב לפני הדגירה. לאחר מכן, פיפטה 1000 מיקרוליטר של מאגר חדירות לכל צינור, צנטריפוגה שוב, ואז השליכו את הסופרנטנט. כדי לתקן את התאים, הוסף מיליליטר אחד של פורמלדהיד 1.6% שהוכן ב-PBS לכל צינור דגימה ומערבולת כדי לערבב את התוכן ביסודיות. לאחר הדגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, יש לצנטריפוגה את הדגימות ולהשליך את הסופרנטנט. עבור צביעת אינטרקלציה גרעינית, יש לדלל תחילה את Cell-ID Intercalator Iridium עם מאגר תיקון וחדירה. פיפטה מיליליטר אחד של תמיסת האינטרקלציה לכל דגימה. מערבבים בעדינות ומערבבים. מניחים את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה, ואז צנטריפוגה כמו קודם. בסיום הדגירה, פיפטה 1000 מיקרוליטר של מאגר צביעת תאים לתוך הצינור. צנטריפוגה את הצינורות בחום של 800 גרם למשך חמש דקות והשליכו את הסופרנטנט. לבסוף, השעו מחדש את התאים ב-450 עד 900 מיקרוליטר של מים נטולי יונים. צבעו את התאים בכחול טריפן לספירת תאים לפני ניתוח נוסף. כדי להתחיל, הפעל את ציטומטר המסה והפעל את התוכנית. לנתח את הדגימות במערכת CyTOF ולרכוש את הנתונים הציטומטריים המסה של התאים החד-גרעיניים בדם ההיקפי ודגימות תאי ההפטוקרצינומה. הפעל את תוכנת עיבוד הנתונים במכשיר ועבד מראש את אוכלוסיית התאים CD45+ בקובץ FCS. לאחר מכן, הסר תאים מתים באמצעות צביעת כדאיות, כגון אי הכללת ציספלטין. גב את אוכלוסיית CD45+ להתמקד בתאי חיסון, וייצא את האוכלוסייה המגודרת לניתוח נוסף. שנה את הנתונים עם גורם משותף של חמישה. לאחר מכן, הפעל את תוכנת האשכולות וזהה את האשכולות העיקריים על סמך אלגוריתם SPADE, קיבוץ תאים עם פרופילי ביטוי סמנים דומים לאשכולות. החל הטמעת שכן סטוכסטית היררכית, או HSNE, להפחתת מימדים וזיהוי אשכולות מובחנים. לאחר מכן השתמש בחבילת ערכת CyTOF בתוכנה שלנו כדי לבצע אשכולות מחדש של האשכולות העיקריים. השתמש בתוכנית PhenoGraph כדי לזהות אשכולות משנה עם פרמטרי ברירת מחדל. בסך הכל זוהו 14 סוגי תאים נפרדים בדגימות התאים החד-גרעיניים של הדם ההיקפי. דפוסי ביטוי הסמן עבור כל אחד מ-14 סוגי התאים פורטו במפת החום, והציגו פרופילי ביטוי ייחודיים עבור אוכלוסיות תאים נפרדות. התפלגות סוגי התאים הללו השתנתה בין דגימות כאשר בדגימה D היה שיעור גבוה יותר של תאי CD4 T, דגימות A ו-B הראו העשרה משמעותית של תאי B, ו-CD141+, תאים דנדריטיים קונבנציונליים, הנמצאים בעיקר בדגימה C. שמונה סוגי תאים זוהו בדגימות הרקמה כולל מונוציטים, תאי T, נויטרופילים, תאי הרג טבעיים, תאי B, תאים דנדריטיים פלסמציטואידים, אאוזינופילים ותאים דנדריטיים מיאלואידים. פרופילי ביטוי סמנים עבור סוגי תאי הרקמה מצביעים על דפוסים מובהקים עבור כל אוכלוסיית תאים. דגימות רקמה הראו שיעור עקבי של סוגי תאים בכל החולים, המשקף מאפיינים אימונולוגיים משותפים עם קרצינומה הפטו-תאית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטת ניתוח ציטולוגיה המונית (CyTOF) להערכת תגובות חיסוניות מערכתיות ומקומיות בסרטן כבד (HCC). על ידי יצירת פרופיל של תאי חיסון ברמת תא יחיד, הגישה מקדמת את ההבנה של הנוף החיסוני והמנגנונים הקשורים להתקדמות הגידול.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום מחקר
- תגובה חיסונית בסרטן כבד
- פרופיל חיסוני ברמת תא יחיד
- אסטרטגיות טיפול מותאמות אישית
רקע
- הבנת התחמקות חיסונית בגידולים
- חשיבות ניתוח הנוף החיסוני
- יישום ציטולוגיה המונית במחקר הסרטן
שיטות בשימוש
- ציטולוגיה המונית לניתוח תאי חיסון
- דגימות סרטן כבד
- זיהוי של מספר רב של סמנים בו זמנית
תוצאות עיקריות
- גילוי של 14 סוגי תאים שונים בדגימות PBMC
- זיהוי של פרופילי ביטוי ייחודיים לתאי חיסון שונים
- אפיון של תגובות חיסוניות בחולים עם HCC
מסקנות
- מחקר זה מוכיח את התועלת של ציטולוגיה המונית לפרופיל חיסוני מעמיק ב-HCC.
- התוצאות משפרות את ההבנה של אינטראקציות תאים-חיסוניים ועשויות להדריך גישות טיפוליות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Mass cytometry enables high-dimensional, single-cell immune profiling in hepatocellular carcinoma (HCC), addressing the challenge of characterizing complex tumor-immune interactions. This approach enhances predictive confidence in identifying immune cell subsets and functional states relevant to disease progression and therapeutic targeting. Integrating systemic and local immune landscape data supports risk-adjusted portfolio decisions in immuno-oncology R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables detailed interrogation of immune cell heterogeneity and functional states in HCC.
- Supports identification of immune evasion mechanisms and potential therapeutic targets.
- Facilitates biological de-risking by clarifying immune pathway involvement in tumor progression.
- Improves predictive confidence for target selection and validation in immunotherapy pipelines.
Screening & Assay Development
- Provides validated, quantitative immune cell marker panels for downstream screening workflows.
- Enables reproducible, high-throughput analysis of immune cell populations across patient samples.
- Supports assay standardization and scalability for immune profiling in translational studies.
- Delivers robust data for evaluating compound effects on specific immune subsets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns immune profiling outputs with disease-relevant biomarkers for translational continuity.
- Enables comparison of systemic and tumor-local immune responses to inform preclinical models.
- Supports risk-adjusted advancement of immunotherapeutic candidates based on mechanistic insights.
- Facilitates identification of shared immunological features across patient cohorts for biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
This mass cytometry workflow bridges early discovery, target validation, and translational research by providing high-resolution immune landscape data in HCC.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on immune cell involvement and pathway activity in tumor progression.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible immune cell marker data for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides high-dimensional readouts and clustering outputs for robust comparison of immune profiles across samples.
- Translational Research: Aligns immune cell signatures with disease state and biomarker strategies for preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for immune profiling across oncology indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune-oncology research.
- Operational Value: Standardizes immune profiling workflows and enhances reproducibility across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation in immunotherapy development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and candidates based on immune landscape data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mass cytometry operation and high-dimensional data analysis.
- Demands access to CyTOF instrumentation and advanced computational tools for clustering and visualization.
- Necessitates standardized protocols for sample preparation and marker panel validation.
- May require adaptation for different tumor types or immune contexts based on marker selection.
- Dependent on robust cross-team collaboration for data interpretation and integration.
