ייצור ותיוג מיקרו-בועות עם עוקבים פלואורסצנטיים ורדיואקטיביים

מיקרו-בועות הן חלקיקים רגישים לאולטרסאונד מלאים בגז עם יכולות הדמיה וטיפול ייחודיות בסרטן. ניתן לקדם את כלי השירות המתפתחים שלהם מבחינה אסטרטגית על ידי בניית מיקרו-בועות הניתנות למעקב. אנו שואפים להקל על מטרה זו על ידי פיתוח פרוטוקול ייצור מיקרו-בועות שומן המאפשר יצירה מותאמת אישית של מיקרו-בועות ללא תווית, עם תווית רדיו, פלואורסצנטית ורב-מודאלית.

השגת תיוג רדיו מיקרו-בועות יעיל ויציב היא אתגר לא טריוויאלי. מיקרו-בועות שומנים הן שבירות ולכן הכפפתן לשלבי חום, זמן וטיהור בגישות תיוג רדיו לאחר הייצור עלולה להפריע לתכונות הכימיות הפיזיקליות וליציבותן. מצד שני, תיוג רדיו טרומי דורש ציוד מיוחד וחשיפה מוגברת לקרינה.

אנו מתגברים על אתגרים אלה על ידי פיתוח פרוטוקול היברידי חדש שבו כלציה רדיואיזוטופית מתרחשת לפני הפעלת מיקרו-בועות, אך לאחר היווצרות תרחיף שומנים. גישה זו של סיר אחד מאפשרת לראשונה תיוג רדיו מיקרו-בועות ביעילות גבוהה וללא טיהור המשמר את התכונות הכימיות הפיזיקליות של החלקיקים. יתרון מרכזי נוסף הוא הרבגוניות של הפרוטוקולים. ניתן לשלב אותו במהלך ייצור מיקרו-בועות מותאם אישית ולהתאים אותו למתלי שומנים מיקרו-בועות מוכנים מראש כמו אלה הזמינים מסחרית. ניתן ליישם אותו בהצלחה על פני קומפוזיציות מגוונות של שומנים וכלאטורים של מיקרו-בועות, ובהתאם לכך יכול ליצור מיקרו-בועות רדיואקטיביות, פלואורסצנטיות או טרימודאליות מותאמות אישית.

יחד, מאפיינים אלה מאפשרים מעקב מייצג רב-מודאלי של קליפות שומנים מיקרו-בועות שיכולות לקדם תובנות מכניסטיות ולתמוך בקידום טיפולי אולטרסאונד ממוקדי מיקרו-בועות בתחומים רבים, כולל מחקר פרמקוקינטי מיקרו-בועות, הדמיה רב-מודאלית, תכנון טיפול ומתן אפשרות לטיפולים סינרגטיים.

[קריין] כדי להתחיל להשתמש במיקרו פיפטה, הוסף מיליליטר אחד של תמיסת AA-PGG לאורך הקצוות של סרט השומנים המיקרו-בועות לבחירתך בבקבוקון, והימנע מהיווצרות בועות. כסה חלקית את פתח הבקבוקון עם המכסה, והשאיר מספיק מקום להכנסת קו הפרפלואורופנטן או ה-PFP. הזרימו PFP לחלל הראש של הבקבוקון למשך 20 שניות מעל הנוזל וכסו את הבקבוקון. טבלו את החצי התחתון של הבקבוקון באמבט מים של 70 עד 80 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. לאחר מכן סוניקציה של הבקבוקון למשך 30 שניות בסוניקטור אמבטיות 69 מעלות צלזיוס. לאחר סוניקציה יש לנגב את הבקבוקון ולאפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר. מלאו מחדש את חלל הראש של הבקבוקון בגז PFP. לאחר מכן מכסים את הבקבוקון ואטומים את הקצוות עם Parafilm. כדי להקים אמבט מים של 60 מעלות צלזיוס בצלחת מתגבשת, הניחו מוט ערבוב מגנטי בכלי והניחו אותו על צלחת ערבוב חמה מבוקרת טמפרטורה. הכנס בדיקה תרמית למים כדי לפקח על הטמפרטורה והתאם את מהירות הערבוב ליצירת משפך חלש אך גלוי. בעזרת מלקחיים, העבירו בקבוקון אטום המכיל נחושת 64 בצורת כלוריד קופרי ב-0.1 חומצה הידרוכלורית רגילה לכיול מינון. רשום את פעילות הנחושת 64 ואת השעה. בעזרת מלקחיים, הוציאו את הבקבוקון מכיול המינון והניחו אותו במיכל עם עופרת. כדי לחשב את הערך במגבקרלים למיליליטר, חלקו את הפעילות המצוינת בכיול המינון בנפח נחושת 64. שחרר את מתלה השומנים ואבטח אותו במחזיק בקבוקון. לאחר מכן פתחו את בקבוקון הנחושת 64, וטפלו בבקבוקון בעזרת מלקחיים. באמצעות מיקרופיפט מעבירים נפח של תמיסת נחושת 64 המתאימה לפעילות של 40 עד 250 מגה-בקרל לתוך תרחיף השומנים. בעזרת מלקחיים שטוחים עם קצה גומי, סובב את מתלה השומנים הרדיואקטיבי למעלה ולמטה לפחות חמש פעמים כדי לערבב את הנחושת 64 לתוך המתלה. בזמן שהבקבוקון בצד ימין כלפי מעלה, יש להניף בעדינות את הפקק תוך כדי ייצוב הבקבוקון. בזהירות, שחרר חלקית את הבקבוקון והכנס קו PFP מצויד במחט. מלאו את חלל הבקבוקון ב-PFP למשך 20 שניות. לאחר מכן מכסים ואטומים את הבקבוקון עם פרפילם. מדוד את פעילות הבקבוקון באמצעות כיול מינון ורשום את השעה. לאחר מכן, הניחו את הבקבוקון במחזיק בקבוקון קצף כך שהמחצית התחתונה של הבקבוקון תיחשף לחום. טבלו את המחזיק באמבט מים מערבבים של 60 מעלות צלזיוס וחממו למשך שעה. בינתיים, להכנת רצועות ה-iTLC, חותכים נייר כרומטוגרפיה מיקרופייבר מזכוכית לרצועות. מחממים את הרצועות בתנור ייבוש זכוכית 80 מעלות צלזיוס להפעלה. לאחר שעה, הוציאו את הבקבוקון מאמבט המים ונגבו את שוליו בנייר טישו. סובב את הבקבוקון למעלה ולמטה באמצעות מלקחיים עם קצה גומי. בזמן שהבקבוקון במצב זקוף, החלק את הפקק תוך כדי ייצוב הבקבוקון. הסר את הפרפילם ונגב סביב הפקק כדי להסיר מים כלואים. הבחין במיקרוליטר אחד עד שניים של מתלה השומנים סנטימטר אחד מהמרכז התחתון של רצועת iTLC מופעלת. הניחו למקום להתייבש. בעזרת מיקרופיפטה, הוסף 200 מיקרוליטר של חומר ניקוי iTLC לתחתית מבחנה של 10 מיליליטר. אכלס את הצינור במיכל עופרת. הוסף את רצועת ה-iTLC המנומרת לצינור ואפשר לה להתפתח עד שהחומר מגיע לסנטימטר אחד מהחלק העליון של הרצועה. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים, הסר את הרצועה שפותחה והחזק אותה אנכית. חותכים את הרצועה לשליש מעל צינורות פלסטיק תואמי מונה גמא של חמישה מיליליטר. הכנס מכסי דחיפה לצינורות. מדוד את הרצועה המכילה צינורות וצינור בקרה ריק באמצעות מונה גמא כדי לזהות פעילות נחושת 64. רשום את הספירה לדקה והפחית את פעילות צינור הבקרה מהקריאות האחרות כדי לתקן את קרינת הרקע. לאחר מכן חשב את טוהר הרדיו הכימי על סמך הספירה המתוקנת לדקה. לאחר מכן, הסר את המכסה של בקבוקון השעיית השומנים המסומן ברדיו והוסף 8.89 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסיד רגיל אחד לתוך המתלה. לאחר מכסה וסיבוב הבקבוקון, הקש בעדינות על הבקבוקון כדי להסיר את המתלה הכלוא בחלל המכסה ומלא את חלל הראש בגז PFP. הנח את הבקבוקון על שייקר מכני והפעל אותו למשך 45 שניות ב-4,530 סל"ד כדי ליצור מתלה מיקרו-בועות חלבי. לאחר קירור פסיבי לטמפרטורת החדר, הפוך בעדינות את הבקבוקון כדי להשעות מחדש את מתלה המיקרו-בועות. הניחו את הבקבוקון על משטח ישר והמתינו שתי דקות. בינתיים, הצטיידו במזרק פלסטיק של מיליליטר אחד במחט בגודל 18 ואווררו את המזרק על ידי שאיבה וצלילה של אוויר פנימה והחוצה. לאחר שתי דקות, פתחו את הבקבוקון במהירות ושאבו 400 עד 550 מיקרוליטר מהמתלה מתחתית הבקבוקון. נגב בזהירות את שולי המחט והעביר את מתלה המיקרו-בועות לצינור מיקרו צנטריפוגה. לאחר סגירת הצינור, מדוד את הפעילות של מוצר המיקרו-בועות הסופי על כיול מינון ושים לב לשעה. חלקו את ערך הפעילות בנפח המנותק כדי לקבל את הפעילות במגה-בקרל למיליליטר. כדי להתחיל, הוסף 10 עד 200 מיקרוליטר של מתלה המיקרו-בועות ליחידת מסנן צנטריפוגה במשקל מולקולרי של 0.5 מיליליטר, 30,000 בצינור מיקרו צנטריפוגה תואם. צנטריפוגה המתלה ב -12,000 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השתמש במספריים כדי לחתוך את החיבור בין צינור המיקרו צנטריפוגה למכסה שלו. הנח את המכסה בבקבוקון נצנוץ של 20 מיליליטר שכותרתו CAPS. העבר את יחידת המסנן לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש שכותרתו TUBE 2. הנח את צינור המיקרו צנטריפוגה הראשון המכיל אינפרנטנט לתוך בקבוקון נצנוץ של 20 מיליליטר שכותרתו TUBE 1. הוסף 200 מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים ליחידת המסנן ב-TUBE 2. צנטריפוגה את יחידת המסנן שוב ב -12,000 גרם למשך 10 דקות. לאחר העברת יחידת המסנן האחרונה, הוסף 200 מיקרוליטר מים מזוקקים ליחידת המסנן בצינור 3 ובצנטריפוגה. לאחר הצנטריפוגה, חותכים את מכסה הצינור, מוסיפים אותו לבקבוקון הנצנוץ של המכסה, ומעבירים את יחידת המסנן לבקבוקון נצנוץ חדש של 20 מיליליטר שכותרתו UNIT. הנח את TUBE 3 בבקבוקון זכוכית חדש של 20 מיליליטר. מכסים את חמשת בקבוקוני הנצנוץ והכינו בקבוקון נצנוץ ריק ומכוסה כבקרה ריקה. מדוד את ששת בקבוקוני הנצנוץ על מונה גמא כדי לזהות פעילות נחושת 64. הפחיתו את פקד הריק ממדידות הבקבוקון האחרות. חשב את יעילות תיוג הרדיו או הכלציה.