פיתוח מערכת פרוטופלסט כרוב לחקר סבילות להיפוקסיה בברסיקה
20 בספטמבר 2024
פרוטוקול זה מתאר מערכת פרוטופלסט יעילה של מזופיל כרוב. נבדקו טיפולים שונים למחסור בחמצן, והמערכת הראתה שפעול גבוה של גנים המגיבים להיפוקסיה, מה שאפשר מחקרים על המנגנונים הגנטיים והמולקולריים של עמידות להצפה בירקות Brassicaceae .
אנו חוקרים כיצד כרוב מגיב לחמצן נמוך ברמה המולקולרית. מכיוון שקשה להשיג כרובים, אנו מפתחים מערכת המשתמשת בתאי כרוב מבודדים. על-ידי חשיפת התאים הרזרביים האלה, הידועים גם בשם פרוטופלסטים, לתנאים דלי חמצן, אנו יכולים לחקור את תגובת העקה שלהם בקלות.
עבודה עם פרוטופלסט שמושהה בתמיסה כדי לחקור תגובות דלות חמצן היא מסובכת. האתגר הגדול הוא לשמור מספיק חמצן לדגימות הבקרה שלנו. מצאנו דרך לשאוב את החמצן שבנוזל.
תיקפנו את השיטה באמצעות בדיקות כתב של סמני היפוקסיה. בדקנו שיטות שונות לטיפול בחמצן נמוך וגילינו שחבילת סופגי החמצן עובדת הכי טוב. הוא קל לשימוש ויעיל, מה שהופך אותו נהדר לחקר האופן שבו פרוטופלסטים מתנהגים בתנאים דלי חמצן.
חקר המנגנון המולקולרי בגידולי עלים בתנאי היפוקסיה היה מאתגר בשל מגבלת הכלים הזמינים, אך עם ההתקדמות האחרונה, התקדמנו מאוד על ידי שימוש במערכת פרוטופלסטים של כרוב עם טיפול בהיפוקסיה. שיטה חדשה זו מסייעת לנו להבין כיצד חמצן נמוך משפיע על צמחים אלה ברמה המולקולרית. בעתיד, אנו מתכננים לשלב את מערכת הפרוטופלסטים עם משקעים חיסוניים ומבחני כתבים כדי להמחיש את מסלול הבקרה המולקולרי המעורב בכרוב במהלך עקת הצפה.
מטרתנו היא לזהות רגולטורים מרכזיים של עמידות להצפות, ואנו מקווים שנסייע בגידול זן כרוב חדש עם עמידות משופרת להצפות. כדי להתחיל, ממלאים את החורים העגולים בצורת ריבוע של מגש תקע 48 בארות במצע צמחי מסחרי וזורעים פויודורי ו-228 זרעי כרוב בעומק של כסנטימטר לתוך מצע הגידול. להכנת 12.5 מיליליטר של תמיסת אנזים, חממו מראש תמיסה המכילה MES של 10 מילימולר ומניטול מולרי 0.6 בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן להוסיף 1.5% צלולאז R-10 ו 0.75% macerozyme R-10. מערבבים את התמיסה וממשיכים לחמם בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הניחו לתמיסת האנזים להתקרר לטמפרטורת החדר.
לאחר מכן להוסיף 10 מילימולר סידן כלורי ו 0.1% אלבומין בסרום בקר. באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר, מעקרים את תמיסת האנזים לתוך צלחת פטרי של תשעה סנטימטרים. לאחר שבועיים-שלושה של צמיחה, אספו שתילי כרוב בשלב העלה השני לבידוד מזופיל פרוטופלסט.
אספו את העלים האמיתיים המורחבים השניים מחמישה עד שמונה שתילי כרוב. בעזרת סכין גילוח חד, פורסים את העלים לרצועות של 0.5 עד 1.0 מילימטר. העבירו מיד את רצועות העלים לתמיסת אנזים טרייה.
יש להעביר את רצועות עלי הכרוב לחדירת ואקום בחושך למשך 30 דקות. לאחר חדירת ואקום, יש לשמור את רצועות העלים שקועות בתמיסת האנזים בחושך למשך ארבע עד 16 שעות. למחרת, לדלל את התמיסה המכילה פרוטופלסטים עם נפח שווה של תמיסת W5 כדי לעצור את העיכול האנזימטי.
כדי לשחרר את ההשעיה של הפרוטופלסטים, מערבלים בעדינות את התערובת על שייקר מסלולי. לאחר מכן סנן את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר. צנטריפוגה את הפתרון protoplast ב 150 G במשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס.
הוסף 10 מיליליטר של תמיסת W5 לאורך דופן הצינור בקצב זרימה של כמיליליטר אחד לשנייה כדי לשטוף את הפרוטופלסטים הכדוריים. לאחר הצנטריפוגה האחרונה, השהה מחדש את הפרוטופלסטים בתמיסת W5 והנח את הצינור על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן הסירו מיליליטר אחד של סופרנאטנט בכל פעם עד שכל הסופרנאטנט מוסר.
השהה מחדש את הפרוטופלסטים בתמיסת MMG מקוררת מראש בקרח. למדוד את ריכוז protoplast באמצעות hemocytometer. כוונן את הריכוז הסופי ל 4 פעמים 10 לעוצמה של 5 פרוטופלסטים למיליליטר באמצעות תמיסת MMG.
לאחר הבידוד והעיכול בלילה, יבול הפרוטופלסטים היה פי 1.04 פי 10 בחזקת 7 עבור פויודורי ופי 4.00 פי 10 בחזקת 6 פרוטופלסטים לגרם משקל טרי עבור 228. יעילות הטרנספקציה של פרוטופלסט הייתה מעל 40% הן בפויודורי והן ב-228 זנים, כפי שהודגם על ידי הגן GFP reporter. לאחר בידוד פרוטופלסט כרוב, מערבבים 100 מיקרוליטר של 4 פעמים 10 בחזקת 4 פרוטופלסטים עם 10 מיקרוליטר פלסמיד ומניחים את התערובת על קרח למשך 10 דקות.
הוסיפו נפח שווה של תמיסת PEG טרייה לתמיסת הפרוטופלסט וערבבו בעדינות. דוגרים על תערובת הפרוטופלסט בטמפרטורת החדר בחושך למשך 10 דקות. לאחר מכן הוסף 440 מיקרוליטר של תמיסת W5 כדי לסיים את התגובה.
צנטריפוגה את הפרוטופלסטים הנגועים ב 150 G למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס. השהה מחדש את הגלולה ב-750 מיקרוליטר של תמיסת W5 מועשרת בחמצן. מעבירים את הפרוטופלסטים המרחפים מחדש לצלחת תרבית רקמה בת שש בארות המקודדת מראש עם אלבומין בסרום בקר 1%.
להיפוקסיה הנגרמת על ידי שקית המכילה חמצן, הניחו צלחת המכילה תמיסת פרוטופלסט W5 בצנצנת אנאירובית בנפח 3.5 ליטר. לאחר מכן הוסיפו לצנצנת שתי חבילות בולמי חמצן ליצירת סביבה היפוקסית. לאחר הטיפול, צנטריפוגות את הפרוטופלסטים ב 150 G למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס.
השליכו את הסופרנאטנט והקפיאו את הפרוטופלסטים שנאספו בחנקן נוזלי לפני שתמשיכו לבדיקת לוציפראז כפולה. חבילת בולמי החמצן גרמה לעלייה של פי 7.0 בפעילות מקדם BoADH1 בהשוואה לקבוצת הביקורת, והדגימה את התגובה ההיפוקסית הגבוהה ביותר. פעילות מקדם BoSUS1L גדלה ביותר מפי 5.6, כאשר הטיפול בחבילת סופגי החמצן הראה את האינדוקציה הגדולה ביותר מבין הטיפולים.
סקירה כללית
מחקר זה חוקר את התגובות המולקולריות של פרוטופלסטים של כרוב לתנאי חמצן נמוך, המדמים מתח הצפה. על ידי פיתוח מערכת פרוטופלסטים חדשה המגבירה את המחקר של גנים המגיבים להיפוקסיה, המחקר נועד להבהיר את המנגנונים הגנטיים העומדים בבסיס סובלנות להצפה בירקות ממשפחת המצליבים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המחקר
- תגובות מתח של צמחים
- סובלנות להצפה בירקות
- מנגנונים גנטיים ומולקולריים
רקע
- כרובים קשים להשגה, מה שמחייב את הצורך במערכת תאית כגון פרוטופלסטים.
- מחקר על תגובות צמחים להיפוקסיה מוגבל על ידי הטכניקות הזמינות.
- הבנת המנגנונים המולקולריים יכולה לשפר מאמצי רבייה לשיפור סובלנות להצפה.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- פיתוח מערכת פרוטופלסטים מבודדת של כרוב באמצעות עיכול אנזימטי.
- חשיפה של פרוטופלסטים לתנאי חמצן נמוך מבוקרים כדי לדמות היפוקסיה.
- שימוש בבדיקות רפורטר כדי לאמת את הפעלת הגנים המגיבים להיפוקסיה.
תוצאות עיקריות
- הקמה מוצלחת של מערכת פרוטופלסטים עם יעילות טרנספקציה גבוהה.
- פרוטופלסטים שנחשפו לטיפולים בספיגת חמצן הראו עלייה משמעותית בביטוי של גנים המגיבים להיפוקסיה.
- אינדוקציה של סמני היפוקסיה מרכזיים שאומתו על ידי בדיקות דואליות של לומינסנציה.
מסקנות
- המחקר מדגיש שיטה יעילה לניתוח התגובות המולקולריות של כרובים לחמצן נמוך.
- התוצאות יכולות להקל על פיתוח זנים של כרובים עם סובלנות משופרת למתח הצפה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Flooding-induced hypoxia is a major threat to Brassica crop yields, demanding robust early-stage tools for dissecting stress tolerance mechanisms. The cabbage protoplast system with controlled hypoxia induction enables rapid, quantitative interrogation of gene function in a transformation-recalcitrant species. This platform advances predictive confidence in target validation and accelerates the identification of molecular regulators for breeding resilient cultivars.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of hypoxia-responsive genes in a physiologically relevant plant system.
- Supports mechanistic de-risking by isolating and quantifying promoter activation under defined oxygen conditions.
- Facilitates rapid hypothesis testing for candidate gene roles in stress adaptation pathways.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, high-yield protoplast isolation and transfection workflow for downstream assays.
- Delivers reproducible, quantitative dual-luciferase readouts for promoter activity under hypoxia.
- Enables scalable screening of genetic constructs or chemical modulators affecting hypoxia response.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular findings with physiological stress responses relevant to crop improvement.
- Supports continuity from gene discovery to trait validation in breeding pipelines.
- Reduces translational risk by modeling stress adaptation in a commercially important species.
Pipeline & Workflow Integration
This protoplast-based system bridges early discovery and pre-breeding, enabling functional genomics, target validation, and quantitative screening in a single workflow.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing for gene function in hypoxia tolerance pathways.
- Screening: Provides validated, reproducible quantitative assays for promoter activation.
- Analytics: Enables statistical comparison of gene activation across treatments and controls.
- Translational Research: Connects molecular responses to phenotypic outcomes relevant for cultivar development.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse gene function and stress response studies in Brassica.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target gene selection for stress tolerance.
- Operational Value: Standardizes protoplast isolation and hypoxia induction for reproducible results.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions for candidate genes in breeding pipelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic targets for crop resilience.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant cell isolation, transfection, and reporter assays.
- Needs access to controlled hypoxia induction equipment and dual-luciferase analytics.
- Demands cross-team standardization of protoplast preparation and assay conditions.
- Adaptation to other Brassica species may require protocol optimization.
- Potential limitations include protoplast viability and scalability for high-throughput studies.
