Name: פיתוח מערכת פרוטופלסט כרוב לחקר סבילות להיפוקסיה בברסיקה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: חקור מנגנונים מולקולריים של סבילות להיפוקסיה בכרוב באמצעות מערכת פרוטופלסט מבודדת. שיטה זו מאפשרת ניתוח תגובות גנים ופיתוח זנים עמידים יותר להצפה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>מערכת Protoplast כרוב יעילה לחקר מנגנוני עמידות להצפה

<ol><li>Tanoue, M., Hirabayashi, Y., Ikeuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global-scale+river+flood+in+the+last+50+years%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Global-scale river flood in the last 50 years.</a> Sci Rep. 6 (1), 36021(2016).</li>
<li>Voesenek, L. aC. J., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flood+adaptive+traits+and+processes%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Flood adaptive traits and processes: An overview.</a> New Phytol. 206 (1), 57-73 (2015).</li>
<li>Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+in+maize+and+Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 127 (4), 1466-1475 (2001).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+transient+protoplast+system+for+analyzing+defense+gene+expression+and+protein-protein+interactions+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">A highly efficient transient protoplast system for analyzing defense gene expression and protein-protein interactions in rice.</a> Mol Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).</li>
<li>Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+A+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+protoplast+isolation%2C+transformation%2C+and+its+application+in+sugarcane+%28Saccharum+spontaneum+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+J%22%5BJournal%5D)">Optimization of protoplast isolation, transformation, and its application in sugarcane (Saccharum spontaneum L).</a> Crop J. 9 (1), 133-142 (2021).</li>
<li>Adedeji, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+protocol+for+efficient+protoplast+isolation+and+transient+gene+expression+in+carnation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Hortic%22%5BJournal%5D)">Optimization of protocol for efficient protoplast isolation and transient gene expression in carnation.</a> Sci Hortic. 299, 111057(2022).</li>
<li>Lin, H. -Y., Chen, J. -C., Fang, S. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protoplast+transient+expression+system+to+enable+molecular%2C+cellular%2C+and+functional+studies+in+Phalaenopsis+orchids%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">A protoplast transient expression system to enable molecular, cellular, and functional studies in Phalaenopsis orchids.</a> Front Plant Sci. 9, (2018).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+mesophyll+protoplast+isolation+and+PEG-mediated+transient+expression+system+in+eggplant%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Hortic%22%5BJournal%5D)">A highly efficient mesophyll protoplast isolation and PEG-mediated transient expression system in eggplant.</a> Sci Hortic. 304, 111303(2022).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+protoplast+isolation+system+for+functional+gene+expression+and+characterization+using+petals+of+Camellia+oleifera%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Development of a protoplast isolation system for functional gene expression and characterization using petals of Camellia oleifera.</a> Plant Physiol Biochem. 201, 107885(2023).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+isolation+of+Populus+mesophyll+protoplasts+and+its+application+in+transient+expression+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Highly efficient isolation of Populus mesophyll protoplasts and its application in transient expression assays.</a> PLOS One. 7 (9), e44908(2012).</li>
<li>Gottschald, O. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIAR+and+TIA-1+mRNA-binding+proteins+co-aggregate+under+conditions+of+rapid+oxygen+decline+and+extreme+hypoxia+and+suppress+the+HIF-1%CE%B1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TIAR and TIA-1 mRNA-binding proteins co-aggregate under conditions of rapid oxygen decline and extreme hypoxia and suppress the HIF-1α pathway.</a> J Mol Cell Biol. 2 (6), 345-356 (2010).</li>
<li>Cho, H. -Y., Chou, M. -Y., Ho, H. -Y., Chen, W. -C., Shih, M. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+modulates+translation+dynamics+in+Arabidopsis+under+submergence+via+GCN2+and+EIN2%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Ethylene modulates translation dynamics in Arabidopsis under submergence via GCN2 and EIN2.</a> Sci Adv. 8 (22), eadm7863(2022).</li>
<li>Boudreau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitation+light+dose+engineering+to+reduce+photo-bleaching+and+photo-toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Excitation light dose engineering to reduce photo-bleaching and photo-toxicity.</a> Sci Rep. 6 (1), 30892(2016).</li>
<li>Shcherbakova, D. M., Cox Cammer, N., Huisman, T. M., Verkhusha, V. V., Hodgson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+multiplex+imaging+and+optogenetics+of+Rho+GTPases+enabled+by+near-infrared+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct multiplex imaging and optogenetics of Rho GTPases enabled by near-infrared FRET.</a> Nat Chem Biol. 14 (6), 591-600 (2018).</li>
<li>Jiang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+sulfite+is+a+potential+hypoxia+inducer+that+mimics+hypoxic+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Sodium sulfite is a potential hypoxia inducer that mimics hypoxic stress in Caenorhabditis elegans.</a> J Biol Inorg Chem. 16 (2), 267-274 (2011).</li>
<li>Lin, C. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUB1A-1+anchors+a+regulatory+cascade+for+epigenetic+and+transcriptional+controls+of+submergence+tolerance+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+Nexus%22%5BJournal%5D)">SUB1A-1 anchors a regulatory cascade for epigenetic and transcriptional controls of submergence tolerance in rice.</a> PNAS Nexus. 2 (7), pgad229(2023).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bis-molybdopterin+guanine+dinucleotide+modulates+hemolysin+expression+under+anaerobiosis+and+contributes+to+fitness+in+vivo+in+uropathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bis-molybdopterin guanine dinucleotide modulates hemolysin expression under anaerobiosis and contributes to fitness in vivo in uropathogenic Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 116 (4), 1216-1231 (2021).</li>
<li>Liu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light+and+hypoxia-induced+gene+zmPORB1+determines+tocopherol+content+in+the+maize+kernel%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+China+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The light and hypoxia-induced gene zmPORB1 determines tocopherol content in the maize kernel.</a> Sci China Life Sci. 67 (3), 435-448 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2-(N-morpholino) חומצה אתנסולפונית (MES)</td><td>PhytoTech Labs</td><td>M825</td><td>להכנת תמיסת אנזים</td></tr><tr><td>228 זרעי כרוב</td><td>Takii & Co., Ltd. (קיוטו, יפן)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>50 מ"ל צינור חרוטי</td><td>SPL מדעי החיים</td><td>50050</td><td>להכנת תמיסת אנזים</td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות 6 בארות</td><td>אלפא פלוס</td><td>16106</td><td>לדגירת פרוטופלסט</td></tr><tr><td>70 &mu; מסננת תאים m</td><td>Sorfa&nbsp;</td><td>SCS701</td><td>לסינון פרוטופלסט</td></tr><tr><td>צלחת פטרי 9 ס"מ</td><td>אלפא פלוס</td><td>16001</td><td>לעיכול</td></tr><tr><td>אנזימטי צנצנת אנאירובית</td><td>HIMEDIA</td><td>צנצנת אנאירובית 3.5</td><td>ליטר לטיפול בהיפוקסיה&nbsp;</td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>להכנת תמיסת W5 וציפוי צלחת תרבית</td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>J.T.Baker</td><td>131301</td><td>להכנת תמיסת W5 ותמיסת PEG</td></tr><tr><td>Cellulase R10</td><td>Yakult</td><td></td><td>להכנת תמיסת אנזים</td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Tarsons&nbsp;</td><td>402030</td><td>לחדירת ואקום</td></tr><tr><td>D-גלוקוז</td><td>ביושופ</td><td>GLU501</td><td>להכנת תמיסת W5</td></tr><tr><td>מד חמצן מומס</td><td>תרמו מדעי</td><td>אוריון כוכב A223</td><td>למדידת חמצן</td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1902</td><td>לתמיסת אנזים, תמיסת PEG והכנת תמיסת MMG</td></tr><tr><td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td><td>Promega</td><td>E1960</td><td>לבדיקת מדווח לוציפראז כפול</td></tr><tr><td>EC-Oxyrase</td><td>Oxyrase Inc.</td><td>EC-0005</td><td>לטיפול בהיפוקסיה</td></tr><tr><td>זרעי כרוב Fuyudori</td><td>Kobayashi Seed Co., Ltd. (Kakogawashi, יפן)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה מקוררת במהירות גבוהה</td><td>היטאצ'י</td><td>CR21GIII</td><td>לקציר פרוטופלסט</td></tr><tr><td>Macerozyme R10&nbsp;</td><td>Yakult</td><td></td><td>להכנת תמיסת אנזים</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>אלפא Aesar</td><td>12315</td><td>להכנת תמיסת MMG</td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td>היטאצ'י</td><td>CT15RE</td><td>לקציר פרוטופלסט</td></tr><tr><td>Microplate</td><td>Greiner</td><td>655075</td><td>לבדיקת מדווח כפול לוציפראז</td></tr><tr><td>מיקרופלייט קורא</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>SpectraMax Mini</td><td>עבור בדיקת מדווח לוציפראז כפול</td></tr><tr><td>Millex 0.22 &mu; מסנן מזרק</td><td>m Merck</td><td>SLGP033RS</td><td>להכנת תמיסת אנזים</td></tr><tr><td>משאבת ואקום ללא שמן</td><td>רוקר Rocker&nbsp;</td><td>נדנדה 300</td><td>לחדירת ואקום</td></tr><tr><td>OxyFluor</td><td>Oxyrase Inc.</td><td>OF-0005</td><td>לטיפול בהיפוקסיה</td></tr><tr><td>חבילת בולם חמצן</td><td>מיצובישי גז כימיקלים החברה</td><td>AnaeroPack, MGCC1</td><td>לטיפול בהיפוקסיה</td></tr><tr><td>רכז חמצן</td><td>UTMOST</td><td>PERFECT AII-X</td><td>לבעבוע חמצן בתמיסת W5</td></tr><tr><td>מצע צמח</td><td>Klasmann-Deilmann</td><td>Potgrond H מצע</td><td>להכנת שתילי כרוב</td></tr><tr><td>פלסמיד מידי ערכת</td><td>QIAGEN</td><td>12145</td><td>לטיהור DNA פלסמיד בדרגת טרנספקציה&nbsp;</td></tr><tr><td>פוליאתילן גליקול 4000</td><td>פלוקה</td><td>81240</td><td>להעברת פרוטופלסט</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>J.T.Baker</td><td>304001</td><td>להכנת תמיסת W5</td></tr><tr><td>סכין גילוח</td><td>ג'ילט</td><td></td><td>להכנת רצועות עלי כרוב</td></tr><tr><td>נתרן</td><td>כלורי ביושופ</td><td>SOD002</td><td>להכנת תמיסת W5</td></tr><tr><td>נתרן סולפיט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S0505</td><td>לטיפול בהיפוקסיה</td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>Yihder</td><td>BU-240D</td><td>להכנת תמיסת אנזים</td></tr></tbody></table>

פיתוח מערכת פרוטופלסט כרוב לחקר סבילות להיפוקסיה בברסיקה

Development of a Cabbage Protoplast System for Studying Hypoxia Tolerance in Brassica

עבודה זו פיתחה בהצלחה מערכת ביטוי ארעי המשתמשת בפרוטופלסטים של כרוב (ראו איור 1 לזרימת עבודה). פרוטופלסטים בודדו מעלי כרוב אמיתיים בני שבועיים עד שלושה שבועות בגודל מתאים (איור 2A) מזני כרוב מסחריים 'Fuyudori' ו-'228' באמצעות עיכול צלולאז/מקרוזים וחדירת ואקום כהה (איור 2B,C). כדי למתן את התנאים ההיפוקסיים שחווים פרוטופלסטים שקועים במהלך הדגירה, תמיסת W5 חומצנה באמצעות בועת אבן אוויר המחוברת למכונת חמצן (איור 2D). תהליך זה העלה משמעותית את ריכוז החמצן המומס בתמיסת W5 מ-7.84 מ"ג· L-1 ± 0.05 מ"ג· L-1 עד 29.18 מ"ג· L-1 ± 0.43 מ"ג· L-1 לאחר 5 דקות של חמצן מבעבע. לאחר תהליך הבידוד, היבול של פרוטופלסטים היה 1.04 x 107 עבור 'Fuyudori' ו 4.00 x 106 protoplasts·g−1 משקל טרי עבור '228' לאחר תקופת עיכול לילה (איור 2E). לאחר מכן, GFP שימש כגן מדווח כדי להעריך את יעילות הטרנספורמציה של שיטת הטרנספקציה בתיווך PEG, מה שהוכיח שיעילות הטרנספקציה של פרוטופלסט בכרוב הייתה מעל 40% בשני הזנים (איור 2F), ובכך אישר את הכדאיות של מערכת זו.
יתר על כן, מבנים מקדמים של גנים לתגובת נשימה אנאירובית של כרוב, BoADH1p::Luc ו-BoSUS1Lp::Luc וקטורים (איור 3A), הוכנסו לפרוטופלסטים של כרוב ככתבים כדי להעריך את השפעות האינדוקציה ההיפוקסית של מספר טיפולים. טיפולים שונים לכוונון חמצן יושמו גם על מערכת מודל ביטוי חולף זו. התוצאות הראו שכל הטיפולים לניקוי חמצן, למעט נתרן סולפיט, גרמו בהצלחה לתגובת היפוקסיה בפרוטופלסטים של כרוב (איור 3B). באופן ספציפי, פעילות המקדם של BoADH1 גדלה בערך פי 2.6 ופי 3.2 בהשוואה לקבוצת הביקורת לאחר הטיפול ב-EC-Oxyrase וב-OxyFluor, בהתאמה, ובעיקר פי 7.0 עם טיפול בחבילת סופגי חמצן (איור 3B). באופן דומה, פעילות מקדם BoSUS1L עלתה בערך פי 1.7 ופי 1.8 עם טיפול EC-Oxyrase ו- OxyFluor, בהתאמה, בעוד שטיפול בחבילות בולמי חמצן גרם לעלייה משמעותית של יותר מפי 5.6 (איור 3B). תוצאות אלה מצביעות על כך שחבילת סופגי החמצן מדגימה יעילות מעולה ביצירת סביבה היפוקסית במערכת ניסוי זו של פרוטופלסט כרוב.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67444/67444fig01.jpg"> 
איור 1: ייצוג גרפי של זרימת העבודה של בידוד פרוטופלסט. איור זה ממחיש את התהליך שלב אחר שלב הכרוך בבידוד פרוטופלסטים מרקמת עלי כרוב. זרימת העבודה מתוארת באופן חזותי כדי לספק הבנה ברורה של ההליך. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67444/67444fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67444/67444fig02v2.jpg"> 
איור 2: בידוד פרוטופלסטים מרקמת העלה של כרוב. (A) מוצגת הופעתם של זני כרוב מסחריים 'Fuyudori' ו-'228' בשלב הגידול המומלץ. העלים האמיתיים השניים שהורחבו במלואם (מסומנים על ידי ראש החץ) של כרוב בשלב 2 העלים נבחרים לבידוד פרוטופלסט. סרגל קנה מידה: 2 ס"מ. (B) משאבת ואקום ומייבש משמשים לתהליך חדירת ואקום של רצועות עלי כרוב, עם חדירה של 30 דקות המבוצעת לפני עיכול אנזימטי. (C) מתואר מצבן של רצועות עלי הכרוב במהלך העיכול האנזימטי. עיכול מלא של רקמת העלה דורש סך של 4-16 שעות. סרגל קנה מידה: 3 ס"מ. (D) תמונות מדגימות שימוש במחולל חמצן המחובר לאבן אוויר כדי להעלות את ריכוז החמצן המומס בתמיסת W5. סרגל קנה מידה: 5 ס"מ. (E) מעל 4.00 x 106 פרוטופלסטים מזופילים לגרם של משקל טרי (FW) התקבלו משני זני הכרוב 'Fuyudori' ו- '228' ונצפו תחת מיקרוסקופ. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. (F) יעילות הטרנספקציה של פרוטופלסטים משני גנוטיפים של כרוב, באמצעות כתב GFP מבוטא באופן קונסטיטוטיבי, מוצגת כמעל 40%. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67444/67444fig02largev2.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67444/67444fig03.jpg"> 
איור 3: תגובת היפוקסיה של פרוטופלסטים של כרוב בתנאים של מחסור בחמצן. (A) מבני גנים של תגובת היפוקסיה, מקדמי BoADH1 ו-BoSUS1L , משמשים ככתבים להערכת תגובת ההיפוקסיה בפרוטופלסטים של כרוב 'פויודורי'. (B) סך של 5 מיקרוגרם של פלסמידים כתבים מועתקים לפרוטופלסטים של כרוב 'פויודורי', אשר מודגרים בתמיסת W5 מבעבעת חמצן לפני חשיפה לטיפולי היפוקסיה במשך 4 שעות. רמות החמצן מופחתות במהלך הדגירה על ידי הוספת EC-oxyrase (0.6 יחידות·mL-1), OxyFluor (0.6 יחידות·mL-1), ונתרן סולפיט (1 g·mL-1) לתמיסת W5. הטיפול בחבילת סופגי החמצן מתבצע על ידי הנחת שתי שקיות בולמי חמצן בצנצנת אנאירובית בנפח 3.5 ליטר. קבוצת "CK" מייצגת את קבוצת הביקורת ללא כל טיפול בהיפוקסיה. לאחר הטיפול, protoplasts נקצרים עבור מבחן לוציפראז כפול. כל ערך מייצג את הממוצע ± SD, עם n = 4. אותיות שונות מצביעות על הבדלים משמעותיים (P &lt; 0.05) בהתבסס על ANOVA חד-כיווני עם LSD לאחר הבדיקה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67444/67444fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: הכנת תמיסת אנזים, תמיסת W5 ותמיסת MMG. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67444/Table%201.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
קובץ משלים 1: פרטי פלסמיד לטרנספקציה פרוטופלסט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67444/Plasmids.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

As climate change brings more heavy rainfall, cabbage, a key Brassicaceae vegetable, faces significant yield losses due to flooding-induced hypoxia ...

development-cabbage-protoplast-system-for-studying-hypoxia-tolerance

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מציג את נוהל בידוד protoplasts שלם מרקמות של 14 יום בן שתילים של ארבידופסיס. בהתחשב בכך protoplasts מבודדים נותרו על כנן לפחות 96h והם מבודדים שתילים במקום אחד בן חודש צמחים בוגרים, הליך זה מזרז מבחני המחייב protoplasts ללא פגע.

בידוד של Protoplasts מרקמות של 14 יום בן שתילים של ארבידופסיס thaliana</em

אנו מתארים פרוטוקול באמצעות שקופיות קאמריות ותקשורת כדי לשתק פסיגי צמחים עבור הדמית confocal של האפידרמיס על פני כמה ימים של פיתוח, המתעד את בידול הפיוניות. חלבוני fluorophore מתויג-ניתן לעקוב באופן דינמי על ידי ביטוי ולוקליזציה subcellular, להגביר את ההבנה של התפקידים האפשריים שלהם במהלך חלוקת תאים והתמיינות תאים מסוג.

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

מאמר זה מתאר את השיטות לסינון גני השליטה חדירה plasmodesmal ומכאן שיפוע אוקסין במהלך התגובה טרופית. זה כולל מדידת מידת התגובה הטרופית ב hypocotyl   של ארבידופסיס thaliana ובדיקת חדירות plasmodesmal ידי טעינת חומצה 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic (HPTS) ולבסוף הערכת רמת callose.

אסטרטגיה כדי לאמת את התפקיד של Gating Plasmodesmal בתיווך Callose במענה חוג

כאן אנו מתארים שיטה חדשה ללמוד יבוא החלבון לתוך כלורופלסטים מבודדים תחת לחץ. השיטה היא מהירה וישירה, וניתן להחיל ללמוד את ההשלכות של תנאי לחץ שונים לייבוא ​​חלבון הכלורופלסט, ואת מנגנוני ויסות המקביל.

ניתוח של ייבוא ​​חלבון לתוך כלורופלסטים מבודדים מצמחים לחוצים

מוצג כאן היא טכניקה פשוטה עבור ברזולוציה גבוהה confocal זמן לשגות הדמיה של פיתוח שורש היפוקוטיל עד 3 ימים באמצעות מטרות צמצם גבוהה מספריים ו perfluorodecalin כמו מדיום טבילה.

חדר פשוט עבור לטווח ארוך הדמיה confocal של שורש ו היפוקוטיל פיתוח

המטרה של פרוטוקול זה היא כדי להדגים כיצד לגרום הפיוניות באשכולות בפסיגי הזרע של שתילים תודרנית לבנה על ידי טיפול טבילה עם פתרון בינוני המכילים סוכר וכיצד להתבונן מבנים תאיים כגון מהכלורופלסט microtubules בתאי המשמר באשכולות באמצעות קונאפוקלית לייזר מיקרוסקופ.

מערכת אינדוקציה מקובצים באשכולות הפיוניות על ידי סוכר פתרון טבילה טיפול בשתילי תודרנית לבנה

שיטה של גידול כרוב הנבט ללא חיידקים פותחה המאפשרת לחוקרים להעריך כיצד מינים בודדים או קהילות מיקרוביאלית מינים אינטראקציה על משטחים עלה כרוב. תמצית ירקות סטרילית מוצגת גם אשר ניתן להשתמש כדי למדוד משמרות בקומפוזיציה קהילתית במהלך תסיסה הירקות.

מערכת גנוטוביוטית לחקר מכלול המיקרוביאום בפילולספירה ובתסיסה הצמחית

אנו מתארים גישה למדידת שינויים ביעילות הפוטוסינתטית בצמחים לאחר טיפול ב-CO2 נמוך באמצעות פלואורסצנציה של כלורופיל.

הערכת היעילות הפוטוסינתטית במוטנטים פוטו-טראומטיים על ידי ניתוח פלואורסצנציה של כלורופיל

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה אופטימלית לתצפית היסטולוגית של גלים המושרים על ידי פלזמודיופורה brassicae. מקטעי ויברטומים של היפוקוטיל מנוקים לפני הדמיה פלואורסצנטית כדי לחקור את המעורבות של גורמי שעתוק ופיטוהורמונים במהלך התקדמות המחלה. פרוטוקול זה מתגבר על מגבלות הטמעת הרגם, ומאפשר הדמיה של חלבונים פלואורסצנטיים בצמחים.

שילוב של מיקרוסקופיית ניקוי ופלואורסצנציה להדמיית שינויים בביטוי גנים ותגובות פיזיולוגיות לפלסמודיופורה brassicae

הפרוטוקול מתאר השראת שורשים שעירים באמצעות גבעולי תפרחת ראשוניים Arabidopsis והיפוקוטיל Brassica napus . ניתן לגדל את השורשים השעירים ולהשתמש בהם כצמחים להתחדשות צמחים טרנסגניים.

טרנספורמציה והתחדשות של שורשים שעירים ב-Arabidopsis thaliana וב-Brassica napus

תכננו פרוטוקול פנוטיפ מבוסס תמונה כדי לקבוע את התגובות המורפולוגיות והפיזיולוגיות לטיפולי חום, בצורת וכריתת מים בודדים ומשולבים. גישה זו אפשרה זיהוי של תגובות מוקדמות, מאוחרות והתאוששות ברמת צמח שלם, במיוחד חלקים מעל פני הקרקע, והדגישה את הצורך בשימוש בחיישני הדמיה מרובים.

פנוטיפ מבוסס תמונה בתפוקה גבוהה לקביעת תגובות מורפולוגיות ופיזיולוגיות ללחצים בודדים ומשולבים בתפוח אדמה

חקור מנגנונים מולקולריים של סבילות להיפוקסיה בכרוב באמצעות מערכת פרוטופלסט מבודדת. שיטה זו מאפשרת ניתוח תגובות גנים ופיתוח זנים עמידים יותר להצפה.

פיתוח מערכת פרוטופלסט כרוב לחקר סבילות להיפוקסיה בברסיקה

גלה סרטונים נוספים