Name: בדיקת יעילות תרגום באמצעות פרופילי פוליזום תחת לחץ חום (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: למדו פרופיל פוליזום לבדיקת יעילות תרגום ב-Arabidopsis תחת לחץ חום. הפרוטוקול מציע שיטה יעילה לבידוד RNA מפוליזומי עם נורמליזציית spike-in לניתוח תרגומי מעמיק.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>ניתוח רגולציה תרגומית בארבידופסיס בסטרס חום

<ol><li>Picard, F., Loubière, P., Girbal, L., Cocaign-Bousquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+translation+regulation+in+the+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">The significance of translation regulation in the stress response.</a> BMC genomics. 14, 1-11 (2013).</li>
<li>Yuan, S., Zhou, G., Xu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+machinery%3A+the+basis+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Genet+Genom%22%5BJournal%5D)">Translation machinery: the basis of translational control.</a> J Genet Genom. 51 (4), 367-378 (2024).</li>
<li>Dever, T. E., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elongation%2C+termination%2C+and+recycling+phases+of+translation+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">The elongation, termination, and recycling phases of translation in eukaryotes.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (7), a013706(2012).</li>
<li>Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).</li>
<li>Dennis, M. D., Browning, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+phosphorylation+of+plant+translation+initiation+factors+by+Arabidopsis+thaliana+CK2+holoenzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential phosphorylation of plant translation initiation factors by Arabidopsis thaliana CK2 holoenzymes.</a> J Biol Chem. 284 (31), 20602-20614 (2009).</li>
<li>Dennis, M. D., Person, M. D., Browning, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+plant+translation+initiation+factors+by+CK2+enhances+the+in+vitro+interaction+of+multifactor+complex+components%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of plant translation initiation factors by CK2 enhances the in vitro interaction of multifactor complex components.</a> J Biol Chem. 284 (31), 20615-20628 (2009).</li>
<li>Chen, G. H., Liu, M. J., Xiong, Y., Sheen, J., Wu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TOR+and+RPS6+transmit+light+signals+to+enhance+protein+translation+in+deetiolating+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">TOR and RPS6 transmit light signals to enhance protein translation in deetiolating Arabidopsis seedlings.</a> Proc Natl Acad Sci. 115 (50), 12823-12828 (2018).</li>
<li>Chang, H. H., Huang, L. C., Browning, K. S., Huq, E., Cheng, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phosphorylation+of+carboxyl-terminal+eIF2%CE%B1+by+SPA+kinases+contributes+to+enhanced+translation+efficiency+during+photomorphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">The phosphorylation of carboxyl-terminal eIF2α by SPA kinases contributes to enhanced translation efficiency during photomorphogenesis.</a> Nat Comm. 15 (1), 3467(2024).</li>
<li>Liu, M. J., Wu, S. H., Chen, H. M., Wu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+translational+control+contributes+to+the+regulation+of+Arabidopsis+photomorphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Sys+Biol%22%5BJournal%5D)">Widespread translational control contributes to the regulation of Arabidopsis photomorphogenesis.</a> Mol Sys Biol. 8 (1), 566(2012).</li>
<li>Des Marais, D. L., Juenger, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropy%2C+plasticity%2C+and+the+evolution+of+plant+abiotic+stress+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+New+York+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Pleiotropy, plasticity, and the evolution of plant abiotic stress tolerance.</a> Ann New York Acad Sci. 1206 (1), 56-79 (2010).</li>
<li>Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+signalling+in+plant+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species signalling in plant stress responses.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (10), 663-679 (2022).</li>
<li>Shulaev, V., Cortes, D., Miller, G., Mittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+for+plant+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Physio+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Metabolomics for plant stress response.</a> Physio Plantarum. 132 (2), 199-208 (2008).</li>
<li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+heat+stress+and+drought+stress+in+pearl+millet+based+on+Pacbio+full-length+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of heat stress and drought stress in pearl millet based on Pacbio full-length transcriptome sequencing.</a> BMC Plant Biology. 20, 1-15 (2020).</li>
<li>Wasternack, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+jasmonates+in+plant+stress+responses+and+development-applied+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Action of jasmonates in plant stress responses and development-applied aspects.</a> Biotechnol Adv. 32, 31-39 (2014).</li>
<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+translational+induction+during+NLR-mediated+immunity+in+plants+is+dynamically+regulated+by+CDC123%2C+an+ATP-sensitive+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Global translational induction during NLR-mediated immunity in plants is dynamically regulated by CDC123, an ATP-sensitive protein.</a> Cell Host Microbe. 31 (3), 334-342 (2023).</li>
<li>Cho, H. Y., Chou, M. Y., Ho, H. Y., Chen, W. C., Shih, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+modulates+translation+dynamics+in+Arabidopsis+under+submergence+via+GCN2+and+EIN2%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Ethylene modulates translation dynamics in Arabidopsis under submergence via GCN2 and EIN2.</a> Sci Adv. 8 (22), eabm7863(2022).</li>
<li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+TaHSFA6e+modulates+heat+shock+protein-mediated+translational+regulation+in+response+to+heat+stress+in+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of TaHSFA6e modulates heat shock protein-mediated translational regulation in response to heat stress in wheat.</a> New Phytol. 239 (6), 2235-2247 (2023).</li>
<li>Maruri-López, I., Figueroa, N. E., Hernández-Sánchez, I. E., Chodasiewicz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+stress+granules%3A+trends+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Plant stress granules: trends and beyond.</a> Front Plant Sci. 12, 722643(2021).</li>
<li>Hamada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granule+formation+is+induced+by+a+threshold+temperature+rather+than+a+temperature+difference+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Stress granule formation is induced by a threshold temperature rather than a temperature difference in Arabidopsis.</a> J Cell Sci. 131 (16), jcs216051(2018).</li>
<li>Jang, G. J., Jang, J. C., Wu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+functions+of+stress+granules+and+processing+bodies+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">Dynamics and functions of stress granules and processing bodies in plants.</a> Plants. 9 (9), 1122(2020).</li>
<li>Ostberg, S., Schewe, J., Childers, K., Frieler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+crop+yields+and+their+variability+at+different+levels+of+global+warming%5BTitle%5D)+AND+%22Earth+Sys+Dyn%22%5BJournal%5D)">Changes in crop yields and their variability at different levels of global warming.</a> Earth Sys Dyn. 9 (2), 479-496 (2018).</li>
<li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+TaHSFA6e+modulates+heat+shock+protein-mediated+translational+regulation+in+response+to+heat+stress+in+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of TaHSFA6e modulates heat shock protein-mediated translational regulation in response to heat stress in wheat.</a> New Phytol. 239 (6), 2235-2247 (2023).</li>
<li>Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+initiation+during+stress+conditions+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling.</a> J Vis Exp. (87), e51164(2014).</li>
<li>Hsieh, E. J., Cheng, M. C., Lin, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+an+abiotic+stress-inducible+transcription+factor+AtERF53+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of an abiotic stress-inducible transcription factor AtERF53 in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Mol Biol. 82, 223-237 (2013).</li>
<li>Cheng, M. C., Liao, P. M., Kuo, W. W., Lin, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+ETHYLENE+RESPONSE+FACTOR1+regulates+abiotic+stress-responsive+gene+expression+by+binding+to+different+cis-acting+elements+in+response+to+different+stress+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis ETHYLENE RESPONSE FACTOR1 regulates abiotic stress-responsive gene expression by binding to different cis-acting elements in response to different stress signals.</a> Plant Physiol. 162 (3), 1566-1582 (2013).</li>
<li>Van den Broeck, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+network+to+phenotype%3A+the+dynamic+wiring+of+an+Arabidopsis+transcriptional+network+induced+by+osmotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Sys+Biol%22%5BJournal%5D)">From network to phenotype: the dynamic wiring of an Arabidopsis transcriptional network induced by osmotic stress.</a> Mol Sys Biol. 13 (12), 961(2017).</li>
<li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((detection+and+identification+of+newly+synthesized+proteomes+with+bioorthogonal+non-canonical+amino-acid+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">detection and identification of newly synthesized proteomes with bioorthogonal non-canonical amino-acid tagging.</a> Nat Protoc. 2 (3), 532-540 (2007).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+de+novo+protein+synthesis+in+starvation-induced+autophagy+using+bioorthogonal+noncanonical+amino+acid+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Acad+Press%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of de novo protein synthesis in starvation-induced autophagy using bioorthogonal noncanonical amino acid tagging.</a> Acad Press. 588, 41-59 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>צינור אפנדורף 1.5 מ"ל</td><td>Labcon</td><td>3012-870-000-9</td><td>מיצוי RNA</td></tr><tr><td>13.2 מ"ל צינור צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>331372</td><td>אולטרה-צנטריפוגה</td></tr><tr><td>ברומופנול כחול Honeywell</td><td></td><td>32712</td><td>פרופיל פוליזום</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>Honeywell</td><td>32211</td><td>מיצוי RNA</td></tr><tr><td>ציקלוהקסימיד (CHX)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>SI-C7698</td><td>פרופיל פוליזום</td></tr><tr><td>דיאתיל פירוקרבונט (DEPC)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D5758</td><td>מיצוי RNA</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>32221</td><td>מיצוי</td></tr><tr><td>RNA ערכת בקרת RNA פולי-A Eukaryotic</td><td>Invitrogen</td><td>900433</td><td>נורמליזציה</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Honeywell</td><td>15523</td><td>נורמליזציה</td></tr><tr><td>הפרין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>SI-H3149</td><td>פרופיל פוליזום</td></tr><tr><td>HiScript III RT SuperMix לערכת qPCR</td><td>Vazyme</td><td>R323-01</td><td>נורמליזציה</td></tr><tr><td>KCl</td><td>J.T.Baker</td><td>&nbsp; 3040-01</td><td>פרופיל פוליזום</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-M8266</td><td>פרופיל פוליזום</td></tr><tr><td>MS מדיום בסיסי</td><td>Phyto</td><td>M524</td><td>תרבית צמחים</td></tr><tr><td>תרשים שיא משאבת מזרק</td><td>ברנדל</td><td>SYN4007LS</td><td>פרופיל פוליזום</td></tr><tr><td>פוליאוקסיאתילן-10-טרידציל-אתר (PTE)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P2393</td><td>פרופיל</td></tr> <tr><td>פוליזוםRNasin</td><td>Promega</td><td>N251B</td><td>פרופיל פוליזום</td></tr><tr><td>נתרן דאוקסיכולט (DOC)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-D6750</td><td>פרופיל פוליזום</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5391</td><td>פרופיל פוליזום</td></tr><tr><td>SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>BP170-8882</td><td>נורמליזציה</td></tr><tr><td>מגיב TRI</td><td>MRC</td><td>TR118</td><td>מיצוי RNA</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>J.T.Baker</td><td>&nbsp; 4109-06</td><td>פרופיל פוליזום</td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>אופטימה L-100K</td><td>אולטרה-צנטריפוגה</td></tr><tr><td>UV/VISDETECTOR</td><td>פרופיל ברנדל</td><td>UA-6</td><td>פוליזום</td></tr></tbody></table>

בדיקת יעילות תרגום באמצעות פרופילי פוליזום תחת לחץ חום

Translation Efficiency Test Using Polysome Profiles Under Heat Stress

הסוג הפראי של ארבידופסיס, Col-0, גודל בתווך טרשת נפוצה תחת פוטופריוד אור של 16 שעות:8 שעות. לצורך הבקרה נעשה שימוש בשתילים בני 5 ימים ללא טיפול בלחץ חום. קבוצת עקת החום עברה שעה אחת של טיפול בחום ב 40 מעלות צלזיוס באמבט מים שחומם מראש, ואילו קבוצת ההתאוששות הונחה על 22 מעלות צלזיוס למשך שעתיים מיד לאחר הטיפול בחום. על ידי שימוש בתנאי טיפול בחום שונים ובתנאי התאוששות, אנו יכולים להשתמש בצעדים הבאים כדי למדוד את יעילות התרגום שלהם.
לפני מיצוי RNA, יש להכין תחילה את שיפוע הסוכרוז. כדי להפריד את הרנ"א הלא-פוליזומלי והפוליזומלי בהתבסס על הפרש הצפיפות ביניהם, הכנו תמיסה הדרגתית עם ריכוזי סוכרוז של 12.5%, 24.4%, 36.3%, 48.1% ו-60%. לאחר מכן העמסנו את תמיסות השיפוע מריכוז גבוה לנמוך, החל מלמטה (איור 1A). לאחר מכן, אנו יכולים להשתמש בשיפוע זה כדי להפריד את הרנ"א הלא-פוליזומלי בצפיפות נמוכה יותר בשכבה העליונה, בעוד שהרנ"א הפוליזומלי בצפיפות הגבוהה יותר יחולק בשכבה התחתונה עם ריכוזי סוכרוז גבוהים יותר. הרנ"א הלא פוליזומלי והפוליזומלי הופקו מ-Col-0 שטופל או לא טופל. כדי למנוע מחלקיקים בתמיסה להשפיע על תוצאות ניתוח פרופיל פוליזום, יש לסנן את התמיסה המכילה RNA דרך מסננת תאים כדי לקבל תמיסת מיצוי ללא חלקיקים. הסופרנאטנט המסונן הועמס על שיפוע סוכרוז שהוכן מראש ושווה. לאחר אולטרה-צנטריפוגה של דגימות טעונות גרדיאנט סוכרוז, הרנ"א הלא-פוליזומלי והפוליזומלי חולקו לפי צפיפות בתוך שיפוע הסוכרוז. לאחר מכן, פרופיל פוליזום בוצע באמצעות מקטע שיפוע צפיפות (איור 1B). מקטע שיפוע הצפיפות נשלט באמצעות תוכנה המכוילת בתחילה עם מים נטולי יונים. לאחר הכיול, הדגימות נטענות על המקטע שלאחר אולטרה-צנטריפוגה. משאבת מזרק המיקרו-נפח, הפועלת במצב בקרת תוכנה, מזריקה תמיסת סוכרוז בריכוזים גבוהים יותר משיפוע הסוכרוז לתוך השיפוע, ודוחפת את הדגימה. זה מאפשר למדידה להתחיל מראש שיפוע הסוכרוז, שם הצפיפות נמוכה יותר, ולהמשיך לכיוון התחתון, שם הצפיפות גבוהה יותר. לאחר מכן, הגדרות התוכנה מופעלות כדי להתחיל באיסוף נתונים, ויוצרות את גרף הפרופיל הפוליזום באמצעות מדידת OD254 (איור 1B). כאשר אנו צופים בעוצמת אות גבוהה יותר בחלק הפוליזומלי, זה מצביע על כך שהדגימה מפגינה יעילות תרגום גבוהה יותר.
החלקות של פרופיל פוליזום עבור שתילי Col-0 בני 5 ימים תחת טיפולים שונים מוצגות באיור 2. התוצאות של קבוצת הביקורת מדגימות הפרדה ברורה בין המקטע הלא-פוליזומלי לבין המקטע הפוליזומלי (איור 2A). אולם לאחר שעה אחת של עקת חום ב-40°C, עוצמת האות של המקטע הרב-סוכרי ירדה באופן משמעותי (איור 2B). כאשר השתילים שטופלו בחום הורשו להתאושש בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, עוצמת האות של המקטע הרב-סוכרי התאוששה לרמה דומה לקבוצת הביקורת (איור 2C). התוצאות שלנו הראו כי טיפול בלחץ חום של שעה אחת הפחית באופן משמעותי את יעילות התרגום של שתילי Arabidopsis. עם זאת, צמחים נדרשו שעתיים של התאוששות כדי להחזיר את יעילות התרגום לרמות דומות לאלה של שתילים שאינם סובלים מעומס חום.
כדי לאסוף ראיות נוספות להשוואת יעילות התרגום של שתילי Col-0 בתנאי טיפול שונים, בודדנו וחילצנו את שברי הרנ"א הלא-פוליזומליים והפוליזומליים. אוסף שברי RNA לא פוליזומליים ופוליזומליים הונחה על ידי תוצאות מדידות פרופיל פוליזום. עבור מיצוי RNA לא פוליסומלי ופוליזומלי, אנו משתמשים בריאגנט פנול/גואנידיניום תיוציאנט כדי לחלץ את דגימות הרנ"א הלא-פוליזומליות והפוליסומליות המבודדות. בעזרת שיטת מיצוי הרנ"א בה השתמשנו, אנו יכולים לקבל רנ"א יציב ואיכותי לניתוח הבא שלנו (טבלה 1). לאחר מכן, נרמל את ה- RNA המופק באמצעות ערכת בקרת ה- RNA Poly-A Eukaryotic Poly-A של GeneChip כדי להפחית שגיאות הנגרמות על ידי הפסדי מיצוי משתנים. לאחר מכן, נעשה שימוש ב-PCR בזמן אמת כדי לכמת את הביטוי של גנים מסוג DAP , הכלולים בגנים B. subtilis שנוספו לערכה. ניתוח השוואתי של רמות ביטוי גנים DAP בין קבוצות RNA לא פוליסומליות ופוליזומליות נערך כדי להעריך את תכולת הרנ"א בתנאים של אובדן פרופורציונלי (איור 3A). חישבנו את היחס בין רנ"א פוליסומלי מנורמל לרנ"א הכולל כדי להבהיר את יעילות התרגום ביניהם (איור 3B). לבסוף, היחס בין רנ"א בפוליזומים חושב באמצעות תכולת הרנ"א המנורמלת (איור 3C). התוצאות של יחס הרנ"א בפוליזומים תחת טיפולים שונים של Col-0 הציגו דפוס עקבי עם תוצאות פרופיל הפוליזום שמוצגות באיור 2A. שתי התוצאות מצביעות על כך שלחץ חום מפחית באופן משמעותי את יחס הרנ"א בחלק הפוליזומלי, וניתן להפוך השפעה זו לאחר התאוששות של שעתיים ב-22°C (טבלה 1).
משיטה זו אנו יכולים לקבל את כל מקטע הרנ"א הלא-פוליזומלי או הפוליזומלי באיכות גבוהה במקום להפריד את הרנ"א לשברים נוספים23. התוצאות שלנו מראות גם כי הן פרופילי פוליזום והן אחוז הרנ"א בפוליזומים יכולים לשקף ביעילות את יעילות התרגום בארבידופסיס עם מצבים מטופלים שונים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67445/67445fig01.jpg"> איור 1: דיאגרמת זרימת עבודה של פרופיל פוליזום. (A) המחשה סכמטית של הכנת שיפוע הסוכרוז בצינור צנטריפוגה בנפח 13 מ"ל. (B) תרשים הזרימה מדגים את התהליך הניסיוני של פרופיל פוליזום. ראשית, התרגום מופק. לאחר מכן, RNA לא פוליזומלי ופוליזומלי מופרדים בהתבסס על הבדלי הצפיפות שלהם באמצעות אולטרה-צנטריפוגה בשיפועי סוכרוז בצפיפויות שונות. OD254 נמדד באמצעות מקטע שיפוע צפיפות כדי לקבל את גרף תוצאות פרופיל הפוליזום להלן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67445/67445fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67445/67445fig02.jpg"> איור 2: פרופיל פוליזום של Col-0 בתנאים שונים. (א, ב, ג) תוצאות פרופיל הפוליזום של Col-0 בתנאים של (A) ללא טיפול בחום (בקרה), (B) טיפול בחום ב-40°C למשך שעה אחת, ו-(C) התאוששות ב-22°C למשך שעה אחת לאחר טיפול בחום. הרנ"א הלא פוליזומלי והפוליזומלי חולקו באמצעות שיפוע סוכרוז של 12.5%-60%. המיקומים של RNA לא פוליסומלי (NP) ופוליזומלי (PL) מסומנים על הפרופילים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67445/67445fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67445/67445fig03.jpg"> איור 3: דיאגרמת זרימת עבודה של חילוץ RNA לא פוליסומלי ופוליזומלי. (A) איור של נורמליזציה של רנ"א על-ידי ספייק אין. (B) המחשה של הפרדת RNA לא פוליסומלי ופוליזומלי וחישוב אחוז RNA פוליזומלי. (C) אחוז הרנ"א הרב-סוכרי ב-Col-0 שטופל במצבים שונים. קווי שגיאה מציינים את הממוצע ± SD (n=3 חזרות ביולוגיות). *ערך p &lt; 0.01, מבחן t של סטודנט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67445/67445fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td></td>
			<td>תוכן (ng)</td>
			<td>260/280</td>
			<td>260/230</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">לשלוט</td>
			<td>רנ"א NP</td>
			<td>758.3</td>
			<td>2.19</td>
			<td>2.16</td>
		</tr><tr><td>RNAPL</td>
			<td>302.3</td>
			<td>2.21</td>
			<td>2.13</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">עקת חום</td>
			<td>רנ"א NP</td>
			<td>821.5</td>
			<td>2.2</td>
			<td>2.15</td>
		</tr><tr><td>RNAPL</td>
			<td>174.3</td>
			<td>2.19</td>
			<td>2.21</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">שחזור</td>
			<td>רנ"א NP</td>
			<td>797.2</td>
			<td>2.17</td>
			<td>2.16</td>
		</tr><tr><td>RNAPL</td>
			<td>300.9</td>
			<td>2.19</td>
			<td>2.18</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: תכולת ואיכויות RNA לא פוליסומלי ופוליזומלי. טבלה זו הראתה את תוכן הרנ"א ואת תכונותיו נותחו. תוכן הרנ"א נורמל לאחר החילוץ בשיטות ששונו.

Translational control of different genes under heat stress is a critical step for plant adaptation to the environment. Assessing the translational ...

translation-efficiency-test-using-polysome-profiles-under-heat-stress

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן, אנו מתארים שיטה לניתוח שינויים בייזום של תרגום ה-mRNA של תאי אוקריוטים בתגובה למצבי לחץ. שיטה זו מבוססת על הפרדת המהירות בשיפועי סוכרוז של תרגום ריבוזומים מהריבוזומים שאינם תרגום.

ניתוח של תרגום ייזום בתנאי לחץ ידי Polysome פרופיל

הריבוזומים לשחק תפקיד מרכזי בסינתזה של חלבונים. חלוקה Polyribosome (polysome) על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות סוכרוז מאפשרת קביעה ישירה של יעילות תרגום של mRNAs הבודד בקנה מידת הגנום כולו. בנוסף, בשיטה זו ניתן להשתמש לצורך הניתוח ביוכימי של הריבוזום וגורמים הקשורים polysome כגון מלווים ומולקולות איתות.

Polysome היפוך חלוק וניתוח של יונקי Translatomes בקנה מידת הגנום

היכולת של תאים להסתגל ללחץ היא קריטית להישרדותם. ויסות תרגום mRNA הוא אסטרטגיית הסתגלות כזו, המספקת ויסות מהיר של הפרוטאום. כאן, אנו מספקים פרוטוקול פרופיל פוליזום סטנדרטי לזיהוי mRNAs ספציפיים המתורגמים באופן סלקטיבי בתנאי לחץ.

הערכת סלקטיבי mRNA התרגום בתאי יונקים ידי Polysome פרופיל

פרוטוקול זה מתאר שיטה קלה לחילוץ ופיצול תעתיקים מרקמות צמחים על בסיס מספר הריבוזומים הקשורים. הוא מאפשר הערכה גלובלית של פעילות התרגום וקביעת סטטוס התרגום של mRNAs ספציפיים.

שיטה קלה הצמח Polysome Profiling

המטרה הכוללת של טכניקה פרופיל polysome הוא ניתוח של פעילות translational של הפרט mRNAs או transcriptome mRNAs במהלך סינתזת החלבון. השיטה זו חשוב ללימודים של רגולציה סינתזה של חלבון, הפעלת תרגום ודיכוי בריאות ומחלות האנושי מרובים.

Polysome פרופיל לישמניה, תאים אנושיים, Testis העכבר

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע polysome פרופיל על הלב העכבר perfused מבודדים. אנו מתארים שיטות הלב זלוף, polysome פרופיל של ניתוח של שברים polysome ביחס mRNAs miRNAs, את פרוטאום polysome.

פרוטיאומיה מבנית ודינמיקה miRNA ניתוח של Polysomes מן הלב העכבר מבודדים לאחר זלוף Langendorff

אנו מציגים טכניקה לייצוב מהיר של מתחמים תרגומיים (ביוסינטזה של חלבונים) עם קשרים צולבים פורמלדהידים בתאי שמרים ויונקים חיים. הגישה מאפשרת לנתח מתווכים ארעיים ואינטראקציות דינמיות של RNA:חלבון. ניתן להשתמש במתחמים המקושרים ביישומים מרובים במורד הזרם, כגון בשיטות פרופיל מבוססות רצף עמוק, מיקרוסקופיה וספקטרומטריית מסה.

קיבוע מהיר ב- Vivo ובידוד מתחמים תרגומיים מתאי אוקריוטיים

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור פרופיל פוליזום מבלי להשתמש ביצרני שיפועים אוטומטיים או במערכות פיצול הדרגתיות.

פרופיל פוליזום ללא יצרני שיפועים או מערכות פיצול

טרנספורמציה של DNA פלסמיד לתוך החיידק שימוש בשיטה הלם חום

בסרטון זה נתאר שיטה להערכת התגובה פסיכו של האדם להדגיש באמצעות ביופידבק. אנו גם מציגים הנחיות כלליות לתכנון הטיפול.

מתח הערכה פסיכו באמצעות ביופידבק

למדו פרופיל פוליזום לבדיקת יעילות תרגום ב-Arabidopsis תחת לחץ חום. הפרוטוקול מציע שיטה יעילה לבידוד RNA מפוליזומי עם נורמליזציית spike-in לניתוח תרגומי מעמיק.

בדיקת יעילות תרגום באמצעות פרופילי פוליזום תחת לחץ חום

גלה סרטונים נוספים