Name: הדמיה של סיאלילציה תוך-תאית עם כימיה של קליק ומיקרוסקופ הרחבה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: למדו הדמיה של סיאלילציה תוך-תאית באמצעות כימיה של קליק ומיקרוסקופ הרחבה. שיטה זו משפרת רזולוציה מרחבית ללא ציוד יקר ומאפשרת חקר ביוסינתזה ומסחר של גליקוקוניוגטים בתאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>מיקרוסקופ הרחבה להמחשת גליקנים סיאלילטים תוך תאיים באמצעות MOE

<ol><li>De Souza, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+at+the+limit%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Light microscopy at the limit.</a> Nat Cell Biol. 11 (Suppl 1), S22(2009).</li>
<li>Tam, J., Merino, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29+in+comparison+with+stimulated+emission+depletion+%28STED%29+and+other+imaging+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) in comparison with stimulated emission depletion (STED) and other imaging methods.</a> J Neurochem. 135, 643-658 (2015).</li>
<li>Jeong, S., Widengren, J., Lee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+probes+for+STED+optical+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">Fluorescent probes for STED optical nanoscopy.</a> Nanomaterials. 12 (1), 21(2021).</li>
<li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543548(2015).</li>
<li>Kang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy+with+a+thermally+adjustable+expansion+factor+using+thermoresponsive+biospecimen-hydrogel+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy with a thermally adjustable expansion factor using thermoresponsive biospecimen-hydrogel hybrids.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 13 (24), 2896228974(2021).</li>
<li>Sun, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click-ExM+enables+expansion+microscopy+for+all+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules.</a> Nat Methods. 18 (1), 107113(2020).</li>
<li>Dube, D., Bertozzi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+oligosaccharide+engineering+as+a+tool+for+glycobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Metabolic oligosaccharide engineering as a tool for glycobiology.</a> Curr Opin Chem Biol. 7 (5), 616625(2003).</li>
<li>Scache, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+azide+and+alkyne+tags+on+bioorthogonal+reporters+in+metabolic+labeling+of+sialylated+glycoconjugates%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Switching azide and alkyne tags on bioorthogonal reporters in metabolic labeling of sialylated glycoconjugates: a comparative study.</a> Sci Rep. 12 (1), 22129(2022).</li>
<li>Holst, S., Wuhrer, M., Rombouts, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+characteristics+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Glycosylation characteristics of colorectal cancer.</a> Adv Cancer Res. 126, 203256(2015).</li>
<li>Boyaval, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Glycomic+signature+of+stage+II+colorectal+cancer+and+its+association+with+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">N-Glycomic signature of stage II colorectal cancer and its association with the tumor microenvironment.</a> Mol Cell Proteomics. 20, 100057(2021).</li>
<li>Ferreira, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+glycosylation+in+gastric+and+colorectal+cancers%3A+Toward+cancer+detection+and+targeted+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Protein glycosylation in gastric and colorectal cancers: Toward cancer detection and targeted therapeutics.</a> Cancer Lett. 387, 32-45 (2017).</li>
<li>Jennings, M. P., Day, C. J., Atack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+bacteria+utilize+sialic+acid+during+interactions+with+the+host%3A+snip%2C+snatch%2C+dispatch%2C+match+and+attach%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">How bacteria utilize sialic acid during interactions with the host: snip, snatch, dispatch, match and attach.</a> Microbiology. 168 (3), 001157(2022).</li>
<li>Gilormini, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sequential+bioorthogonal+dual+strategy%3A+ManNAl+and+SiaNAl+as+distinct+tools+to+unravel+sialic+acid+metabolic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">A sequential bioorthogonal dual strategy: ManNAl and SiaNAl as distinct tools to unravel sialic acid metabolic pathways.</a> Chem Commun. 52 (11), 2318-2321 (2016).</li>
<li>Vanbeselaere, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkynyl+monosaccharide+analogues+as+a+tool+for+evaluating+Golgi+glycosylation+efficiency%3A+application+to+Congenital+Disorders+of+Glycosylation+%28CDG%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">Alkynyl monosaccharide analogues as a tool for evaluating Golgi glycosylation efficiency: application to Congenital Disorders of Glycosylation (CDG).</a> Chem Commun. 49 (96), 11293-11295 (2013).</li>
<li>Gilormini, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+glycomics+enrichment%3A+imaging+the+recycling+of+sialic+acid+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inherit+Metab+Dis%22%5BJournal%5D)">Chemical glycomics enrichment: imaging the recycling of sialic acid in living cells.</a> J Inherit Metab Dis. 4 (3), 515523(2018).</li>
<li>Rigolot, V., Biot, C., Lion, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+view+your+biomolecule%2C+click+inside+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem%22%5BJournal%5D)">To view your biomolecule, click inside the cell.</a> Angew Chem. 60 (43), 2308423105(2021).</li>
<li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cysteine+S-glycosylation+induced+by+per-O-acetylated+unnatural+monosaccharides+during+metabolic+Glycan+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem%22%5BJournal%5D)">Artificial cysteine S-glycosylation induced by per-O-acetylated unnatural monosaccharides during metabolic Glycan Labeling.</a> Angew Chem. 130 (7), 1835-1838 (2018).</li>
<li>Qin, K., Zhang, H., Zhao, Z., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+S-glyco-modification+through+an+elimination-addition+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Protein S-glyco-modification through an elimination-addition mechanism.</a> J Am Chem Soc. 142 (20), 9382-9388 (2020).</li>
<li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+Huisgen+cycloaddition+process%3A+Copper%28I%29-catalyzed+regioselective+%26%2334%3Bligation%26%2334%3B+of+azides+and+terminal+alkynes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem%22%5BJournal%5D)">Stepwise Huisgen cycloaddition process: Copper(I)-catalyzed regioselective &#34;ligation&#34; of azides and terminal alkynes.</a> Angew Chem. 41 (14), 25962599(2002).</li>
<li>Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strain-promoted+%5B3+%2B+2%5D+azide%E2%88%92alkyne+cycloaddition+for+covalent+modification+of+biomolecules+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">A strain-promoted [3 + 2] azide−alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems.</a> J Am Chem Soc. 126 (46), 15046-15047 (2004).</li>
<li>Mbua, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-promoted+alkyne-azide+cycloadditions+%28SPAAC%29+reveal+new+features+of+glycoconjugate+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Strain-promoted alkyne-azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis.</a> ChemBioChem. 12 (12), 19121921(2011).</li>
<li>Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine+ligation%3A+Fast+bioconjugation+based+on+inverse-electron-demand+Diels-Alder+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Tetrazine ligation: Fast bioconjugation based on inverse-electron-demand Diels-Alder reactivity.</a> J Am Chem Soc. 130 (41), 1351813519(2008).</li>
<li>Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine-based+cycloadditions%3A+Application+to+pretargeted+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Tetrazine-based cycloadditions: Application to pretargeted live cell imaging.</a> Bioconjug Chem. 19 (12), 22972299(2008).</li>
<li>Bird, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+chemistry+and+its+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal chemistry and its applications.</a> Bioconjug Chem. 32 (12), 2457-2479 (2021).</li>
<li>Slade, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+CHO+secretome+using+mucin-type+O-linked+glycosylation+and+click-chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Identifying the CHO secretome using mucin-type O-linked glycosylation and click-chemistry.</a> J Proteome Res. 11 (12), 61756186(2012).</li>
<li>Gambarotto, D., Hamel, V., Guichard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+expansion+microscopy+%28U-ExM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure expansion microscopy (U-ExM).</a> Methods Cell Biol. 161, 5781(2021).</li>
<li>Gambarotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+ultrastructures+using+expansion+microscopy+%28U-ExM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM).</a> Nat. Methods. 16, 71-74 (2019).</li>
<li>Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper-catalyzed+azide-alkyne+click+chemistry+for+bioconjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation.</a> Curr Protoc Chem Biol. 3 (4), 153-162 (2011).</li>
<li>Santiago, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+swelling+behaviour+of+poly%28sodium+acrylate%29%2Fsepiolite+superabsorbent+composites+and+nanocomposites%5BTitle%5D)+AND+%22Polym+Int%22%5BJournal%5D)">Synthesis and swelling behaviour of poly(sodium acrylate)/sepiolite superabsorbent composites and nanocomposites.</a> Polym Int. 55 (8), 843848(2006).</li>
<li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+direct+grafting+strategies+via+trivalent+anchoring+for+enabling+lipid+membrane+and+cytoskeleton+staining+in+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy.</a> ACS Nano. 14 (7), 78607867(2020).</li>
<li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+progress+in+expansion+microscopy%3A+Chemical+strategies+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Current progress in expansion microscopy: Chemical strategies and applications.</a> Chem Rev. 123 (6), 32993323(2023).</li>
<li>Drelich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+high+spatially+resolved+proteomics+using+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Toward high spatially resolved proteomics using expansion microscopy.</a> Anal Chem. 93 (36), 12195-12203 (2021).</li>
<li>Zwettler, F. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+resolution+imaging+by+post-labeling+expansion+single-molecule+localization+microscopy+%28Ex-SMLM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM).</a> Nat Commun. 11 (1), 3388(2020).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy+with+multifunctional+polymer+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy with multifunctional polymer dots.</a> Adv Mater. 33 (25), 2007854(2021).</li>
<li>Klimas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnify+is+a+universal+molecular+anchoring+strategy+for+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy.</a> Nat Biotechnol. 41 (6), 858869(2023).</li>
</ol>

פרוטוקול התיוג הנוכחי של CuAAC אינו כולל אמינוגואנידין במאגר התגובה. מכיוון שהוא מכוון להמחשת גליקוקונוגטים תוך-תאיים, הוא מבוצע על תאים המקובעים לאחר שלב השילוב המטבולי, כדי למנוע כל בעיית ציטוטוקסיות ולשפר את ספיגת המערכת הקטליטית. השימוש באמינוגואנידין מומלץ בדרך כלל לתיוג פני התא של תאים חיים כדי למנוע תגובות לוואי בין דהידרו-אסקורבט לשאריות ארגינין, היסטידין, וליזין של חלבונים28. שינויים אלה אכן יכולים להשפיע על תפקוד החלבון ועלולים לגרום להפרעות או ציטוטוקסיות. שיקול חשוב נוסף עבור מאגר התגו...

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, למרות שנמצאת בשימוש נרחב לתיוג והדמיה של מולקולות ספציפיות בתוך תאים, מוגבלת מטבעה ברזולוציה על ידי מגבלת העקיפה של אור1 של Abbe, המגבילה את היכולת להבחין בין עצמים הקרובים יותר מ-200-250 ננומטר בקירוב. מגבלה זו נובעת מאופי הגל של האור ומהצמצם המספרי של עדשת האובייקטיביות של המיקרוסקופ, מה שמציב אתגר בעת הדמיית מבנים תת-תאיים. התגברות על מגבלות אלה מספקת תובנות טובות יותר לגבי תהליכים ביולוגיים מסוימים בקנה מידה ננומטרי.
כדי לעבור את גבול העקיפה של האור, פותחו טכניקות מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה כגון STORM (מיקרוסקופיה לשחזור אופטי סטוכסטי) ו-STED (דלדול פליטה מגורה) 2,3. STORM מסתמך על הפעלה סטוכסטית של פלואורופורים, המאפשרת לדמות רק תת-קבוצה דלילה בכל זמן נתון. זה מאפשר לוקליזציה מדויקת של פלואורופורים בודדים, המאפשרת שחזור של תמונה ברזולוציה גבוהה. STED, לעומת זאת, משפר את הרזולוציה על ידי שימוש בלייזר דלדול כדי להרוות באופן סלקטיבי את הקרינה סביב הפריפריה של נקודת העירור, ולמעשה מצמצם את פונקציית התפשטות הנקודה.
גישות אלו מנוגדות למיקרוסקופיה רחבת שדה או קונפוקלית, שבה כל הפלואורופורים מזוהים בו זמנית, וכתוצאה מכך תמונה המשלבת את כל דפוסי העקיפה ומונעת את ההבחנה בין פלואורופורים בודדים קרובים, מה שמוביל לאובדן רזולוציה. עם זאת, שיטות סופר-רזולוציה אלה דורשות מקורות אור ספציפיים מאוד, ציוד, הכנת דגימות ו/או פלואורופורים, מה שהופך את הטכנולוגיות הללו ליקרות, קשות לגישה ברוב המעבדות ומאתגרות ליישום בניסויים שגרתיים. אילוצים אלה הובילו את הקהילה המדעית לחפש פתרונות חלופיים להשגת רזולוציה גבוהה יותר, שיהיו תואמים לציוד מיקרוסקופיה זמין ולפרוטוקולי צביעה שגרתיים. בשנת 2015 פותחה שיטה לעקוף את מגבלות המיקרוסקופיה האופטית על ידי הרחבה פיזית של הדגימה על ידי בוידן ועמיתיו, הנקראת מיקרוסקופיית הרחבה (ExM)4.
ExM היא שיטה תלת-שלבית המספקת פרטים בקנה מידה ננומטרי של דגימות ביולוגיות מבלי לחרוג מגבול העקיפה של האור (איור 1). במקום זאת, הוא משתמש במיקרוסקופים קונבנציונליים מוגבלים בעקיפה כדי לצלם דגימות שהוגדלו פיזית בצורה איזוטרופית. השלב הראשון, הנקרא ג'לציה, מורכב מהטמעת הדגימה הביולוגית, בדרך כלל תאים או רקמות קבועות, בהידרוג'ל פוליאלקטרוליט מתנפח המבוסס על נתרן אקרילט ואקרילאמיד. לאחר מכן הדגימה הביולוגית עוברת טיפול אנזימטי כדי לפרק חלקית רכיבים מסוימים כגון חלבונים או ממברנות, ולפרק מבנים תאיים צפופים כדי להבטיח שהתאים יוכלו להתרחב באופן אחיד. שלב זה, הנקרא עיכול, מסייע להשיג זאת על ידי הומוגניזציה של הרכיבים המבניים של הדגימה ביחס לתכונות מכניות, ומניעת התרחבות דיפרנציאלית שעלולה להוביל לעיוות של הדגימה. לבסוף, בשלב האחרון, הנקרא הרחבה, הדגימה המוטמעת והמעוכלת בהידרוג'ל מונחת במים נטולי יונים, מה שגורם לה להתנפח. טכנולוגיה זו מביאה להרחבת הדגימה במקדם הגדלה ליניארי של כ-4-5x בכל ממד, מה שמאפשר הדמיה של פרטים תאיים עדינים באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה סטנדרטיות. בהתחשב באופי האיזוטרופי של ההתפשטות, הדגימה הביולוגית המוגדלת בתוך מטריצת הג'ל שומרת על הפרטים הגיאומטריים התלת מימדיים שלה ועל היחסים המרחביים בין מרכיביה המבניים השונים. מידע מרחבי נשמר, אם כן, עם נפיחות, בעוד שהמרחק בין התוויות הפלואורסצנטיות המעוגנות בג'ל או הביו-מולקולות גדל באופן אחיד לכל הכיוונים. זה מאפשר הפרדה טובה יותר של אותות, וכתוצאה מכך רזולוציה משופרת.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67479/67479fig01.jpg"> 
איור 1: סקירה כללית של פרוטוקול ExM. (א) ג'לציה: הדגימה הביולוגית מעוגנת ומוטמעת בתוך הידרוג'ל פוליאלקטרוליט מתנפח. (ב) עיכול: התכונות המכניות של הדגימה הומוגניות באמצעות שימוש באנזימים וחומרי ניקוי, פירוק חלבונים וממברנות שומנים שאחרת היו מגבילים את ההתפשטות ויוצרים עיוותים. (ג) התרחבות: ההידרוג'ל טובל במים נטולי יונים, מה שגורם לו להתרחב בצורה איזוטרופית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67479/67479fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
מאז 2015, ExM ראתה שיפורים טכנולוגיים משמעותיים בשימור מידע מרחבי. בפרט, עוגנים מולקולריים שונים תוכננו לחבר באופן קוולנטי ביומולקולות ישירות להידרוג'ל המתנפח 5,6. בפרוטוקול זה, השתמשנו ב-N-acryloxysuccinimide (NAS), המגיב עם קבוצות האמין החופשיות של ביומולקולות (בדרך כלל, שאריות ליזין או מיקומי N-terminal של חלבונים) כדי להצמיד קבוצת אקרילויל לחלבוני התא, כולל גליקופרוטאינים. קבוצת אקרילואיל זו מגיבה לאחר מכן עם מונומרים אחרים באמצעות תגובות צולבות במהלך הג'לציה, ומעגנת את הביו-מולקולות הללו ישירות לפולימר.
ExM תואם למגוון רחב של שיטות תיוג, כולל הנדסת אוליגוסכריד מטבולית (MOE). MOE הוא כלי רב עוצמה המאפשר תיוג של גליקנים על ידי שילוב אנלוגים של קודמנים מטבוליים המצוידים בידית כימית ביו-אורתוגונלית7. אנלוגים אלה, הידועים כמדווחים כימיים, משתלבים במסלולים מטבוליים מבלי לגרום לרעילות. בגישת MOE, חד-סוכרים מדווחים מעובדים מטבולית לסוכרי נוקלאוטידים פעילים ולאחר מכן מועברים לגליקו-מצומדים מתהווים. ההתמקדות העיקרית שלנו היא בחקר הסיאלילציה, במיוחד הדינמיקה התוך-תאית והסחר ב-N-גליקופרוטאינים סיאליליים, שהיא חיונית בהקשר של בריאות ומחלות בשל תפקידיה באינטראקציות תא-תא, ויסות חיסוני והתפתחות. סיאלילציה לא תקינה מעורבת במחלות כמו סרטן 8,9,10,11, מחלות זיהומיות 12 והפרעות גנטיות 13,14,15, מה שהופך אותה ליעד מרכזי לפיתוח טיפולי וגילוי סמנים ביולוגיים. הבנת סיאלילציה משפרת את התובנות לגבי גליקוביולוגיה ומנגנוני מחלות.
ניתן לחקור סיאלילציה באמצעות MOE עם אנלוגים של חומצה N-אצטילנוראמינית (Neu5Ac), החומצה הסיאלית הנפוצה ביותר בבני אדם, או עם אנלוגים של N-אצטילמנוזאמין (ManNAc), קודמן מטבולי של Neu5Ac, הנושא ידית ביואורתוגונלית 8,16. ManNAc מומר ל-Neu5Ac בציטוזול, ולאחר מכן מופעל לחומצה נויראמנית ציטידין-5′-מונופוספו-N (CMP-Neu5Ac) בגרעין. לאחר הפעלתם לסוכר נוקלאוטיד, סיאליל טרנספראזות במנגנון גולגי מעבירות יחידות Neu5Ac למיקומים הסופיים של שרשראות גליקן גדלות (איור 2). בעקבות השילוב המטבולי של נגזרות ManNAc לא טבעיות, ניתן לקשר את הגליקנים המתויגים של סיאליל באופן קוולנטי לפלואורופור הנושא קבוצה תגובתית משלימה לידית המדווח באמצעות כימיית קליק ביואורתוגונלית. זה מאפשר התבוננות ישירה בגליקוקונוגטים in vivo או ex vivo.
עבור רוב המדווחים על חד-סוכרים, נדרשת צורה פראצטילית כדי לחצות את קרום הפלזמה באמצעות דיפוזיה פסיבית. עם זאת, הוכח כי הן מדווחים פראצטיליים והן מדווחים לא מוגנים חוקרים ביעילות סיאלילציה16. מדווחי סיאלילציה לא מוגנים מסוגלים להיכנס לתאים על ידי מנגנוני הובלה פעילים, כלומר פינוציטוזיס עבור אנלוגים של Neu5Ac, וטרנספורטר שעדיין לא זוהה עבור ManNAc. בעוד שסוכרים לא מוגנים דורשים ריכוז גבוה יותר (בדרך כלל 100-500 מיקרומטר) כדי להשיג השפעות דומות, ברגע שהם נכנסים לתא, הם יכולים להיכנס ישירות למסלול המטבולי של חומצה סיאלית. לעומת זאת, סוכרים שעברו פראצטילציה צריכים לעבור דה-אצטילציה מלאה על ידי אסטרזות לא ספציפיות תוך תאיות לפני שהם הופכים לפעילים מטבולית. למרות שניתן להשתמש בהם בריכוזים נמוכים יותר (בדרך כלל 10-50 מיקרומטר), דה-אצטילציה לא מלאה עלולה להפריע לפעילות האנזים או להוביל לשילוב של אנלוגים של חומצה סיאלית אצטילית חלקית, מה שעלול להטות את הניתוח במורד הזרם. בנוסף, שחרור חומצה אצטית עשוי להשפיע על ה-pH באופן מקומי, מה שעלול להשפיע על תפקוד התאים. צ'ן ועמיתיו הראו גם שסוכרים פר-O-אצטילטים מגיבים עם שאריות ציסטאין חופשיות בחלבונים באמצעות מנגנון לא אנזימטי, מה שמוביל לשילוב מחוץ למטרה ולאות לא ספציפי מוגבר17,18. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מעסיקים לכן כתבי ManNAc לא מוגנים.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67479/67479fig02.jpg"> 
איור 2: הנדסת אוליגוסכריד מטבולית ותיוג של חומצות סיאליות. UDP-GlcNAc מומר ל-ManNAc על ידי תחום UDP-GlcNAc 2-epimerase של GNE/MNK בציטוזול. לאחר מכן ManNAc עובר זרחן בציטוזול על ידי תחום ManNAc 6-kinase של GNE/MNK ליצירת ManNAc-6-phosphate. N-acetylneuraminate synthase מזרז את העיבוי של ManNAc-6-P עם פוספואנולפירובט כדי לייצר Neu5Ac-9-phosphate, אשר לאחר מכן עובר דה-פוספורילציה על ידי חומצה סיאלית פוספטאז כדי להניב Neu5Ac. Neu5Ac יכול להיות מסופק גם על ידי מסלול ההצלה באמצעות אנדוציטוזיס ומיחזור ליזוזומלי8. לאחר הובלה לגרעין, הוא מומר ל-CMP-Neu5Ac על ידי CMP-חומצה סיאלית סינתטאז. במנגנון גולגי, CMP-NeuAc הוא המצע של סיאלילטרנספראזות המציגים חלק Neu5Ac במיקומים הסופיים של גליקנים על גליקוקונוגטים מתבגרים, אשר בסופו של דבר מתבטאים בקרום התא או מופרשים. מדווחים כימיים של ManNAz הנושאים ידית ביואורתוגונלית יכולים לחדור לתא דרך טרנספורטר פעיל לא מזוהה ולהיכנס למסלול המטבולי. יחידות ה-Neu5Az המתויגות המשולבות בגליקנים לאחר ביוסינתזה מסומנות לאחר מכן באמצעות צימוד בתיווך CuAAC של בדיקה פלואורסצנטית. קיצורים: NAc = N-אצטיל; UDP-GlcNAc = אורידין דיפוספט N-אצטיל גלוקוזאמין; ManNAc = N-אצטילמנוסמין; GNE = UDP-GlcNAc 2-אפימראז; MNK = ManNAc 6-קינאז; ManNAc-6-P = ManNAc-6-פוספט; NANS = N-acetylneuraminate synthase; PEP = פוספואנולפירובט; Neu5Ac = חומצה N-אצטילנוראמינית; Neu5Ac-9-P = Neu5Ac-9-פוספט; NANP = חומצה סיאלית פוספטאז; CMP = ציטידין-5′-מונופוספט; CMAS = CMP-חומצה סיאלית סינתטאז; STs = sialyltransferases; ManNAz = N-azidoacetylmannosamine; Neu5Az = חומצה N-azidoacetylneuraminic. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67479/67479fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
בין התגובות הביו-אורתוגונליות האפשריות, מיקדנו את התעניינותנו בתוספת ציקלו-אזיד-אלקין (CuAAC)16,19. על פי הניסיון שלנו, CuAAC היא האפשרות הטובה ביותר לתיוג גליקנים תוך-תאיים בתאים קבועים. תגובה זו מבוססת היטב, נחקרה ביסודיות בכימיה ביואורתוגונלית, ותוקננה לשימוש בסביבות ביולוגיות מורכבות, ומספקת בסיס איתן של ידע ופרוטוקולים אופטימליים. הקינטיקה המהירה שלו אכן מציעה יעילות תגובה וסגוליות גבוהה, והוא כולל קבוצות אזיד ואלקין שקל לסנתז, יציבות, נעדרות ממערכות חיות ואינרטיות כלפי ביומולקולות מקומיות, מה שהופך אותו לאידיאלי עבור יישומי תאים קבועים שבהם רעילות נחושת אינה מהווה בעיה. תוספת אלקין-אזיד (SPAAC)20,21, תוך הימנעות מהרעלת נחושת, יש קינטיקה איטית יותר ובדיקות מגושמות יותר, מה שנוטה להוביל לאות רקע גבוה יותר ולירידה ביחס האות לרעש עבור יישומים תוך-תאיים עקב לכידה הידרופובית, בעוד שביקוש אלקטרונים הפוך Diels-Alder (IEDDA)22,23למרות שהוא מהיר ונטול נחושת, כרוך בסינתזה מורכבת יותר של בדיקה ודורש קבוצות מדווחים מגושמות יותר שעדיין לא אופיינו במלואן ביישומי MOE., מכיוון ש-ExM דורש אך ורק תאים קבועים, CuAAC מציע פתרון חזק ויעיל לתיוג ביו-אורתוגונלי.
מאמר זה מציג פרוטוקול להדמיה של גליקופרוטאינים סיאליליים תוך-תאיים בתאים, המשלב תיוג מטבולי, כימיה של קליק ביו-אורתוגונלי ומיקרוסקופ הרחבה. בהליכי הניסוי המתוארים במאמר זה, אנו משתמשים ב-N-azidoacetylmannosamine (ManNAz) כמדווח הכימי, וקשירת CuAAC של פלואורופורים אורגניים קטנים מתבצעת לפני הליך ההרחבה. גליקופרוטאינים מעוגנים להידרוג'ל עם NAS לפני הג'לציה, העיכול וההרחבה. תיוג MOE של חומצות סיאליות יכול להיות קשור לגישות אימונופלואורסצנטיות להערכת לוקליזציה משותפת, כפי שמודגם כאן עם נוגדן ראשוני נגד GM130 של עכבר הממוקם במנגנון cis-Golgi. ניתן ליישם פרוטוקול זה על תאים במצבם הפיזיולוגי, או על תאים שעברו טיפול כימי. כדי להמחיש זאת, כלורוקווין שימש לעיכוב התפקוד הליזוזומלי, המשפיע על העיבוד והסחר של גליקופרוטאינים בתוך התאים. צביעה גרעינית משמשת כציון דרך, לא רק לאיתור תאים אלא גם כאינדיקטור לאיכות תהליך ה- ExM. אכן ניתן למדוד את גורם ההתפשטות על ידי השוואת גודל הגרעין לפני ההתפשטות (preExM) ואחרי ההתפשטות (postExM).

<table><tbody><tr><td>(+) נתרן L-אסקורבט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים 12 באר</td><td>קורנינג</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>אקרילאמיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A8887</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אקרילית N-hydroxysuccinimide ester&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A8060</td><td></td></tr><tr><td>אלקסה פלואור 488 אלקין&nbsp;</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-1277-5</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 עיזים נגד עכברים IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11003</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>9913</td><td></td></tr><tr><td>ביס-אקרילאמיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>146072</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>BTTAA</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-067-100</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה 2 מ"ל</td><td>EPPENDORF</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>מלח כלורוקווין דיפוספט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C6628</td><td></td></tr><tr><td>צינור חרוטי 15 מ"ל</td><td>פלקון</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי מחליק 12 מ"מ #1</td><td>epredia</td><td>CB00120RA120MNZ0</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי מחליק 32 מ"מ #1</td><td>epredia</td><td>CB00320RA140MNZ0</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>DMEM מדיום גלוקוז גבוה&nbsp;</td><td>Dutscher</td><td>L0104-500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Salt (PBS)&nbsp;</td><td>Dutscher</td><td>L0615-500</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>biowest</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>פיברובלסט 533T</td> <td>-</td><td></td> <td>נאסף מאדם בריא</td></tr><tr><td>FIJI ImageJ 2.9.0</td> <td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>ביו-RAD</td><td>170-6537</td><td></td></tr><tr><td>גואנידין HCl</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>50950</td><td></td></tr><tr><td>תאי HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 10.2</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Euromedex</td><td>PB0447-B</td><td>נטול מים</td></tr><tr><td>LSM 780 מיקרוסקופיה קונפוקלית&nbsp;</td><td>Zeiss-MCF7</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>N-אצטילמנוזאמין (ManNAc)</td><td>BIOSYNTH</td><td>MA05269</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carlo Erba</td><td>479687-N-azidoacetylmannosamine</td><td></td></tr><tr><td>(ManNAz)</td><td>BIOSYNTH</td><td>MA46002</td><td></td></tr><tr><td>Objectif "Plan-Apochromat" 63x/1,4 Oil DIC M27</td><td>Zeiss</td><td>420782-9900-799&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מי מלח חוצץ פוספט (PBS) 10x</td><td>Euromedex</td><td>ET330</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2308</td><td>מ&nbsp; Tritirachium album</td></tr><tr><td>עכבר מטוהר GM130 נוגדן</td><td>BD Bioscience</td><td>610822</td><td>50 ומיקרו; g</td></tr><tr><td>נתרן אקרילט&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>408220</td><td></td></tr><tr><td>T75 בקבוק</td><td>קורנינג</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>tris אצטט EDTA (TAE) 10x</td><td>Euromedex</td><td>EU0202-B</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Dutscher</td><td>702630</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA 1x</td><td>Dutscher</td><td>L0930-100</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה של סיאלילציה תוך-תאית עם כימיה של קליק ומיקרוסקופ הרחבה

Visualizing Intracellular Sialylation with Click Chemistry and Expansion Microscopy

להלן היישום של הפרוטוקול להמחשת גליקופרוטאינים סיאליליים בתאי HeLa (איור 3A) ותאי MCF7 (איור 3B), תוך השמטת טיפול ב-CQ (סעיף פרוטוקול 2) וצביעה של אימונופלואורסצנציה (שלב פרוטוקול 5.3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67479/67479fig03.jpg"> 
איור 3: השוואה של תבנית תיוג הסיאלילציה לפני (משמאל) ואחרי (מימין) של פרוטוקול ExM. <...

Metabolic labeling techniques allow the incorporation of bioorthogonal reporters into glycans, enabling the targeted bioconjugation of molecular dyes ...

visualizing-intracellular-sialylation-with-click-chemistry-expansion

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Neisseria meningitidis (ננומטר), שלילי גרם אדם ספציפי פתוגן הנשימה, ניתן לאגד את האדם α-actinin. כאן אנו מציגים פרוטוקול להדמיה של colocalisation של החיידק עם תאיים α-actinin לאחר כניסת חיידקים לתוך כלי הדם לתאי המוח האנושי האנדותל (HBMECs).

Visualisation וכימות של אינטראקציות תאיים של Neisseria meningitidis ואת האדם α-actinin על ידי הדמיה confocal

חלקיקים adenovirus מתוכננים להכיל אנלוגי טבעי חומצת אמינו azidohomoalanine או סוכר...

שינוי Chemoselective של משטחים ויראלי באמצעות כימיה לחץ Bioorthogonal

בסרטון זה, אנו מדגימים זיהוי של חומצות סיאליות, חומצה N-אצטיל-נוירמינית וחומצה N-גליקולילינוירמינית, באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, HPLC, לאחר דה-ריווטציה עם מגיב תיוג פלואורסצנטי מתאים כדי לסייע בזיהוי פלואורסצנטי.

כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בשלב ההפוך: שיטה חזקה לכימות של חומצות סיאליות עם תווית פלואורסצנטית ופירוק שבודדו מכבד עכבר

סרטון זה מדגים את הביוטינילציה והתיוג הפלואורסצנטי של סיאלוגליקופרוטאינים שעברו שינוי בתאי גזע עצביים ראשוניים ובתאי אב, כמו גם נוירונים, והדמייתם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

צביעה אימונופלואורסצנטית של סיאלוגליקופפרוטאינים בתאי אב עצביים ובתאי עצב

מיקרוסקופיה Intravital היא כלי רב עוצמה המאפשר הדמיה של תהליכים ביולוגיים שונים בבעלי חיים. במאמר זה, אנו מציגים שיטה מפורטת להדמית הדינמיקה של מבני subcellular, כגון גרגרי ההפרשה, בבלוטות הרוק של עכברים חיים.

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

תקשורת בין-תאית היא קריטית לשליטה בפעילות פיזיולוגית שונות בתוך ומחוץ לתא. מאמר זה מתאר פרוטוקול למדידת טבע מרחב ובזמן של הפרשות תא בודדות. כדי להשיג זאת, גישה רב תחומית המשלבת משמשת nanoplasmonic ללא תווית חישה עם הדמיה תא חי.

טכניקה ללא תווית להדמית החלל-הזמן של פרשות תא בודדת

חומצה sialic היא אופיינית חד-סוכר-יחידה נמצאו ב- glycoconjugates. זה מעורב שפע של אינטראקציות מולקולרית, תאית. כאן אנו מציגים שיטה כדי לשנות את תא השטח חומצה sialic הביטוי תוך שימוש glycoengineering מטבולית עם N- acetylmannosamine נגזרים.

Glycoengineering מטבולית של חומצה Sialic באמצעות N-acyl השומן-שונה Mannosamines

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה ומאפשר הפריט החזותי כמותית של היווצרות מורכבות של חלבונים מוקש, המבוססת על העברת האנרגיה תהודה פורסטר, ואורך חיים פלורסצנטיות הדמיה במיקרוסקופ.

להמחיש מוקש תאיים סחר על-ידי קרינה פלואורסצנטית שלמים הדמיה במיקרוסקופ

המחקר של acylation שומן יש השלכות חשובות אינטראקציות חלבון הסלולר ומחלות. מוצג כאן הוא פרוטוקול שונה כדי לשפר את זיהוי הכימיה קליק של חלבונים acylated שומן, אשר ניתן ליישם בסוגי תאים שונים בשילוב עם בדיקות אחרות, כולל מרדף דופק ספקטרומטריית מסה.

שילוב ממוטב של אנלוגים לחומצת שומן אלקיניל לגילוי חלבונים אצטט שומניים באמצעות כימיה קליק

מוצגת כאן גרסה חדשה של מיקרוסקופ הרחבה (ExM), Magnify, המותאמת להרחבה של עד פי 11, תוך שימור מערך מקיף של מחלקות ביומולקולות, ותואמת למגוון רחב של סוגי רקמות. הוא מאפשר לחקור את התצורה הננומטרית של ביומולקולות באמצעות מיקרוסקופים קונבנציונליים מוגבלי עקיפה.

שימור מולקולרי אוניברסלי עם מיקרוסקופ הרחבה פי 11

מוצג פרוטוקול ייחודי ומקיף ליצירת תאים דנדריטיים אנושיים שמקורם במונוציטים אנושיים (mo-DCs) מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים מבודדים (PBMCs) באמצעות טיפול בסיאלידאז. יתר על כן, מתוארות שיטות להערכת האפיון הפנוטיפי והפונקציונלי של mo-DCs ולהעריך כיצד טיפול בסיאלידאז משפר את רמת ההתבגרות של mo-DCs.

יצירת תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים עם פנוטיפים סיליליים שונים

למדו הדמיה של סיאלילציה תוך-תאית באמצעות כימיה של קליק ומיקרוסקופ הרחבה. שיטה זו משפרת רזולוציה מרחבית ללא ציוד יקר ומאפשרת חקר ביוסינתזה ומסחר של גליקוקוניוגטים בתאים.

הדמיה של סיאלילציה תוך-תאית עם כימיה של קליק ומיקרוסקופ הרחבה

גלה סרטונים נוספים