תהליך עבודה מהיר ופשוט לכימות מבני דרוזופילה חיצוניים למבוגרים

המעבדה שלנו מתעניינת בהבנת האופן שבו דינמיקת pH תוך-תאית מווסתת התנהגויות תאי. אנו מתעניינים בהתנהגויות התורמות להתקדמות הסרטן מכיוון שאנו יודעים כי pH תוך תאי מוגבר ברוב סוגי הסרטן. אנחנו עושים הרבה מיקרוסקופיה ומפתחים פרוטוקולים לכימות נתונים מהתמונות האלה.

אנו לומדים יותר על מסלולים ותהליכים תאיים המווסתים על-ידי pH. לרוב קווי התאים הסרטניים יש pH תוך-תאי גבוה יותר ורבים מראים רמות מוגברות של אוטופגיה, אך לא ידענו שזה קשור. לאחרונה הראינו כי pH תוך-תאי גבוה יותר בתאים נורמליים מבחינה גנטית מספיק כדי להגביר אוטופגיה.

המעבדה שלנו היא אחת המעבדות הבודדות החוקרות כיצד pH תוך-תאי או PHI מווסת התנהגויות תאים במודל שלם של בעלי חיים. מצאנו כי PHI מוגבר מקדם התרבות תאים מוגברת, נדידת תאים פולשנית וחוסר ארגון רקמות. לאחרונה, מצאנו כי PHI גבוה יותר מקדם אוטופגיה, שהיא צורה של קניבליזם תאי.

אנו מטפלים בפער שנוצר עקב העלות הגבוהה והמורכבות של הכנת דגימות עבור SEM, המגביל את נגישותו למעבדות רבות. במדינת סן חוזה, חסרים לנו המשאבים עבור SEM. לכן פיתחנו פרוטוקול נגיש וזול יותר המאפשר לנו לצלם תמונות ברזולוציה גבוהה ללא צורך בציוד יקר.

פרוטוקול זה משלב טכניקות מסורתיות המשמשות באנטומולוגיה ומציע חלופה חסכונית וידידותית למשתמש לסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים. זה יכול להיות מותאם בקלות כדי ללכוד תמונות ברזולוציה גבוהה של חלקים שונים של הזבוב או דגימות שונות. כדי להתחיל, בחר את זן drosophila הרצוי ומניחים אותו בקבוקון המכיל מזון זבובים.

דוגרים על הבקבוקון בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עד שהזבובים גדלים והבוגרים קרובים. לאחר מכן, להרדים את הזבובים הבוגרים עם פחמן דו חמצני ולהניח אותם על כרית פחמן דו חמצני. הכינו סדרן זבוב נוצות על ידי חיתוך נוצת אווז כך שתתאים לקצה המחודד של פיפטה סרולוגית של מיליליטר אחד.

מיין את הזבובים עם נוצה ובחר את הפרטים עם כנפיים ישרות. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של 70% אתנול לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה 1.7 מיליליטר. מעבירים את הזבובים שנבחרו לתוך הצינור ומניחים את הצינור על קרח.

באמצעות ניקוב נקודתי מיוחד. חתכו נקודות משולשות קטנות ממלאי כרטיסי ארכיון של 65 פאונד. לאחר מכן השתמשו במלקחיים עדינים מסוג Dumont מספר חמש כדי לכופף את קצה כל נקודה לזווית של 90 מעלות.

הסר את הזבובים מצינור מיקרו צנטריפוגה באמצעות מלקחיים דקים מספר חמש של Dumont. כתם בעדינות את הזבובים עם רקמה ללא סיבים כדי להסיר אתנול עודף. הניחו כל זבוב על צדו השמאלי על כרטיס אינדקס תחת מיקרוסקופ מנתח.

בעזרת פיפטת העברה, מערבבים טיפה אחת או שתיים של דבק הסתרה עם טיפה אחת או שתיים של מים נטולי יונים. הרימו נקודת קלף מוכנה בקצה הרחב בעזרת מלקחיים וטבלו את הקצה הכפוף לתוך תערובת מי הדבק כדי למרוח כמות קטנה של דבק. יש למרוח את הקצה הכפוף של נקודת הקלף על הצד הקדמי של בטנו הימנית של הזבוב סביב מקטעי בטן שניים ושלושה.

לפני שהדבק מתייבש, התאימו את הזבוב כך שהציר האחורי הקדמי שלו יהיה מאונך לקצה הכפוף של נקודת הקלף. הכנס פין הרכבה מספר שלוש לקצה הרחב של נקודת הכרטיס, וחבר אותו לבלוק הצמדת חרקים. תייג כל סיכה או שורת סיכות בגנוטיפ המתאים.

כדי לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה של עיני דרוזופילה רכובות נקודתיות, הפעל את מערכת ההדמיה בערימה. לאחר מכן הגדר גוף מצלמת DSLR עם עדשת טלפוטו 70 עד 200 מילימטר המחוברת למטרה של מיקרוסקופ Apo 20x באמצעות מתאם עדשת 77 מילימטר. ודא שהדגימה מוארת באמצעות הבזק באמצעות מפזר אדים.

שלוט במיקום Z של המצלמה באמצעות בקר StackShot ומסילת מאקרו. מקם את הזבוב המורכב על הנקודה על גימבל הבמה האוניברסלי כשהעין פונה לעדשה. כוונן את מיקום הראש, תוך שימוש בזהירות במלקחיים ליישור אופטימלי.

חבר את המצלמה למחשב נייד והתאם את הגדרות הרכישה. הגדר את ההגדלה ל- 20x, מהירות תריס, 1/200 שנייה, צמצם f/2.8 ו- ISO 400. לאחר מכן, הגדר את המיקום לשמירת אוסף התמונות שנוצר בתיקיית הקבצים הרצויה.

כעת, התאם את הגדרות ערימת המיקוד ביחידת הבקרה StackShot במצב מרחק אוטומטי. הגדר את גודל הצעד לחמישה מיקרומטרים וחשב את מספר השלבים על-ידי הגדרת מיקומי ההתחלה והעצירה של ערימת המיקוד. הצג את הדגימה במצב תצוגה חיה כשהמצלמה במצב צילום אוטומטי.

הזיזו את המסילה כך שהחלק הקרוב ביותר של הדגימה יהיה ממוקד. לאחר מכן, עבור לתכונה הרחוקה ביותר של עניין והתאם את המיקוד. החזר את המצלמה למצב צילום ידני והתחל את רכישת התמונה מיחידת הבקרה StackShot.

לאחר ההדמיה, פתחו את קובצי התמונה שנרכשו בתוכנת ערימת המיקוד שאליה מתבצעת הפניה. בחרו 'ערימה' ולאחר מכן יישרו וערמו הכל או Pmax ליצירת תמונה מוערמת. לאחר מכן לחץ קובץ ושמור תמונת פלט כדי לשמור את התמונה המוערמת הסופית כקובץ טיף.

לאחר הדמיה של עיני דרוזופילה המותקנות על סיכות, בחר את התמונה המוערמת לניתוח שבה העין ממורכזת ומיושרת עם תאורה נאותה וטשטוש היקפי מינימלי. פתח את תמונת סרגל קנה המידה של 500 מיקרומטר בתוכנת פיג'י. מדדו את אורך סרגל קנה המידה בעזרת הכלי קו ישר.

לחץ על נתח ומדוד כדי להקליט את מרחק הפיקסלים, המתאים ל- 500 מיקרומטר. לאחר מכן, חשב פיקסלים למיקרון והשתמש בזה כדי להמיר מדידות פיקסלים למדידות מיקרומטר. פתח את קובץ התמונה המוערם בפיג'י.

בחר זכוכית מגדלת מסרגל הכלים כדי להגדיל את אזור המיקוד. מלאו את המסך בקוטיקולה של העין והראש שמסביב. לאחר מכן, מסרגל הכלים, בחר בכלי הבחירה ביד חופשית ותאר את אזור הרשתית לאחר השורה החיצונית ביותר של ommatidia.

להסרת חלק מהבחירה, לחצו לחיצה ממושכת על לחצן האפשרויות ובחרו בפיקסלים להסרה. להוספה לבחירה, לחצו לחיצה ממושכת על לחצני האפשרויות וההזחה ובחרו בפיקסלים להוספה. כדי לחשב את האזור, בחר נתח ומדוד.

חלון חדש יציג את הפרמטרים של האזור, הממוצע, המינימום והמקסימום. העתק והדבק את הנתונים בגיליון אלקטרוני לצורך תיעוד והמרה מפיקסלים למדידות מיקרומטר. ביטוי יתר של DNhe2 בזבובי GMR-DNhe2 הביא לעיניים בוגרות קטנות משמעותית בהשוואה לזבובים בוגרים מסוג בר.

זבובי GMR-DNhe2 הראו ירידה של 41% בשטח העיניים בהשוואה לזבובי בר וירידה של 48% בהשוואה לזבובים הטרוזיגוטיים GMRGAL4. גודל העיניים שוחזר בזבובי GMR-DNhe2 עבור אלל Atg1 3, מה שהביא אותו ל-129.9 מיקרומטר רבוע מ-74.28 מיקרומטר רבוע.