Name: הכנת כדורי אקדח ין transfection Biolistic של נוירונים תרבות Slice (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 42 s
Description: למדו הכנת כדורי זהב מצופי DNA לטרנספקציה ביוליסטית של נוירונים בפרוסות היפוקמפוס מתורבתות. שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה יעילה של תאים בודדים ברקע נקי לחקר מורפולוגיה נוירונלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות סמן Lucanic ו-Hwai ג&#39;ונג צ&#39;אנג לעזרה עם רכישת תמונות בהגדלה נמוכה של פרוסות בהיפוקמפוס כולו מוצג הווידאו הזה. אנחנו רוצים גם להודות שרה פריש עבור סיוע עם הטקסט המלווה את הסרטון.

פרוטוקול transfection BIOLISTIC הכנת כדורי כדורים טובים עד 6 חודשים, אך עלול להתחיל ירידה יעילות transfection לאחר 2-3 חודשים. תבליטים צריך להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס בנוכחות כדורי dessicant. תמיד להניח צלוחיות הנצנץ, שבו הכדורים מאוחסנים, חם לטמפרטורת החדר לפני פתיחת הבקבוקון. לפני תחילת העבודה יש ​​להכין: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Spermidine (0.05M) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CaCl 2 (1M) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EtOH (100% גבוהה כיתה בקבוק סגור) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Autoclaved H 2 0 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דנ&quot;א להיות transfected </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Polyvinylpyrrolidone (PVP-20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​המלאי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 X 15 מ&quot;ל חרוטי (2/bullet סט) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Tubing (חתך לתוך 1 X ~ 30 אינץ&#39; / להגדיר כדור) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Scintillation בקבוקונים (סט 1/bullet) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התייבשות כדורי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 מ&quot;ל מזרק w / צינורות בצד </li></ul> הכן צינורות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש ~ 30 אינץ&#39; של צינורות (בערך 2 ס&quot;מ מעבר הרחבת זכות O-Ring) בתחנת צינורות w / N 2 גז (0.4 הלחץ) למינימום של 20 דקות. </li></ol> מזרז DNA על חרוזי זהב: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ה-DNA כדי להיות transfected בנפח 50 סך μmL בצינור microcentrifuge (50 מיקרוגרם לכל היותר DNA הכולל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את 6-8 מ&quot;ג של זהב להעביר צינור microcentrifuge </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של spermidine 0.05M אל זהב sonicate עבור 20 שניות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את μL 50 של ה-DNA של זהב / spermidine </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס (סביב הגדרת 5) w / מכסה פתוח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ירידה μL חכם של 100 1M CaCl 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate בקצרה (&lt;5 שניות) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לזרז עבור 10 דקות ב temp חדר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate בקצרה </li></ol> הכן פתרון PVP במהלך sonication: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את לדלל פתרון PVP ב 15 מ&quot;ל חרוטי, 3.5mL לדלל PVP עבור כל קבוצה של כדורים (להוסיף 7.5 μL של המניה PVP 20mg/ml ל -3.5 מ&quot;ל EtOH 100%) </li></ol> שטיפה עם חרוזי זהב EtOH: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה חרוזי זהב במלוא המהירות על 10 שניות ב microcentrifuge </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, אבל לשמור על כמות קטנה של נוזל על גבי חרוזי זהב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3X עם 1ml EtOH, sonicate בקצרה בכל פעם, אם יהיה צורך </li></ol> Resuspend זהב / DNA בתמיסה PVP: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה זהב μL 200 של פתרון 3.5 מ&quot;ל PVP / EtOH לדלל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת כדורית הזהב resuspend (בקצרה sonicate במידת הצורך) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את μL 200 זהב / פתרון ל PVP חדש 15 מ&quot;ל חרוטי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך בדרך זו, והוסיף 200 μL של PVP בכל פעם עד שכל הזהב הועבר 15 מ&quot;ל חרוטי, ואת הנפח הסופי הוא 3.2 מ&quot;ל </li></ol> ציפוי צינורות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל N 2 בתחנת צינורות ולהסיר צינורות יבשים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף צינורות יבשים מזרק 10 מ&quot;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוקף לנער את 15 מ&quot;ל חרוטי מלא זהב / PVP </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את קצה הצינורית זהב / פתרון PVP ולמצוץ לאט להיות זהיר, כדי למנוע בועות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר ~ 2 אינץ&#39; יבש משני הקצוות של הצינור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם צינור המחובר עדיין מזרק מלא פתרון זהב / PVP, בזהירות המקום בחזרה צינורות לתוך התחנה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את קצות צינורות שבו פתרון יושב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו הזהב להסתפק 5 דקות עם מזרק המצורף </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצצי-up הפתרון לאט מאוד על ידי משיכת את המזרק כך התיישבו זהב הוא נשאר מאחור (לוודא שלא לשטוף גב) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתק את המזרק </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב 90 ° ולתת לשבת 2 שניות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיבוב 180 מעלות ולתת לשבת עוד 2 שניות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיבוב הצינור למשך 5 שניות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את N 2 שסתום כך נכתב בין 0.4-0.5 ו - ספין בצינור מצופה זהב תוך ייבוש דקות 5. </li></ol> חיתוך צינורות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צינורות מתחנת-הכנה בצינור וכיבה את ומסתיים הסימנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים בקבוקון scintillation מתויג תחת המסוק צינורות לתפוס מחסניות לחתוך </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום צינורות במסוק צינורות וחתך את צינורות עם סכין נקי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כדורי התייבשות בבקבוקון scintillation </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן מחסניות ב 4 ° C </li></ol> קליעה Slices רקמות בעת הירי פרוסות בתרבית, חשוב להעסיק טכניקה סטרילי יחסית, כדי למנוע זיהום. זכור, כי בעת הירי בשני דגמים שונים, שתי קבוצות של כדורים ניתן לטעון לתוך המחזק את המחסנית זהה, אך חבית אניה המסך צריך להיות שונה בין המבנים. לפני תחילת העבודה יש ​​להכין: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה-DNA כדורים (שלא בקבוקון scintillation חמים לטמפרטורת החדר לפני הפתיחה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות פרוסות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליוס Gene Gun </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיכל הליום עם צינור אקדח גן מצורף &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> טונר בעל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אניה חבית פלסטיק עם O-Ring במקום </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מפזר (שינה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מפזר מסך </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצבטים </li></ul> Prepping את האקדח הגן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחיים שימוש במקום מחסניות פלסטיק מצופה זהב לתוך המחזק את המחסנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום בעל מחסנית לתוך אקדחו הגן על ידי הראשון להדוף לנעול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Secure בעל מחסנית עם מנעול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג אניה חבית עם טבעת-O ואת המסך מפזר בבטחה במקום </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בורג חבית אניה לתוך האקדח גן </li></ol> קליעה פרוסות תרבותי עם אקדח הגן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשים על אטמי אוזניים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את האקדח לתוך הגן מחובר טנק צינור גז הליום </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הלחץ על הטנק PSI 180 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תירה ריק לאוויר על מנת להסיר כל אבק או פסולת מן המסך מפזר. כדי לירות באקדח, תחילה לדכא את לחצן בטיחות משתלבים עד צפצופים אקדח, ואז ללחוץ על ההדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הירי ריק, להסיר את פרוסות מן החממה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מראש אקדח תחילה לבנות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תירה עם המסך מפזר על 0.5-1 ס&quot;מ מן הפרוסה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מראש את מחסנית בין בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הירי גם האחרון, במקום פרוסות בחזרה לתוך החממה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את לחץ הגז ולשחרר לפני ניתוק את האקדח מן הצינור הליום </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הברג החוצה את אניה לחבית, ולהסיר את מחסנית הפגזים בשימוש </li></ol> ניקוי מחסנית בעלי ספינות חבית: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום מחסניות, ספינות לחבית, מסכי מפזר בכוס עם מים וסבון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כוס ב sonicator אמבטיה sonicate עבור 20 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות לשטוף עם מים עד שכל שאריות סבון יוסרו </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים EtOH 70% למשך שעה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים על מגבת נייר יבשה לילה יבש </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחסניות נקי, ספינות לחבית, מסכי מכן ניתן לעשות שימוש חוזר transfections biolistic הבאים </li></ol> הירי צרות טיפים transfection Biolistic Transfection Biolistic יכולה לפעמים לגרום transfection תנאים טובים. זה יכול להוביל מעט מדי או יותר מדי תאים רבים transfected, גבוה מדי או נמוך מדי רמות הביטוי, או עלול לגרום פרוסות הרקמה להיות בריא בדרך כלל. לעיתים קרובות התוצאה פרוסות בריא מהפיצוץ את הלחץ. הנה כמה טיפים כדי לקבל פרוסות הרקמה transfected בצורה אופטימלית. אם פרוסות להיראות בריא (או אם תאים רבים מדי transfected / פרוסה), נסה: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הירי הגדלת מרחק </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחתת הלחץ על מיכל הדלק </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחתת כמות זהב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך החוצה את מרכז מפזר Bio-Rad והחלפת מרכז עם מסך מפזר. </li></ul> אם תאים מעטים מדי הם transfected, נסה: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקטנת מרחק הירי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ הולך וגובר על מיכל הדלק </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדלת כמות של זהב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדלת מספר פרוסות הרקמה / טוב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוודא O-Ring ב-לחבית אניה לא נפגע. </li></ul> אם אתה לקבל פרוסות עם שני תאים רבים מדי, מעט מדי transfected במהלך הירי באותו לוודא: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כי אתה מחזיק את האקדח באופן סימטרי מעל היטב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהב כי היא שווה הציפוי הפנימי של צינורות. (אם אתה מקבל שורה של זהב, למשוך את supernatant מן הצינור בקצב מהיר פעם זהב יש התיישבו וסובב את הזהב כבר לפני הפעלת חנקן. אם, מצד שני, אתה מקבל פסים של זהב , זה צפוי עקב חשיפה לחות רבה מדי במהלך ביצוע כדור: ודא שאתה משתמש בקבוק סגור של EtOH, כי צינורות הוא יבש לחלוטין לפני הציפוי, וכי אתה מכסת מכסים הכנת כדורי מבעוד מועד). </li></ul> אם יעילות transfection נראה אופטימלי (# תאים transfected / פרוסה), אך רמת הביטוי נראה גבוה מדי או נמוך מדי: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את ה-DNA יחס זהב. (למשל, אם הוא נמוך מדי לשמור על כמות של זהב אלא להגדיל את כמות ה-DNA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את כמות הזמן בין ירי ואיסוף נתונים </li></ul> במקרה של transfection כפול, אם אתה מקבל ביטוי מעט מדי של אחד המבנים שלך, לשנות את היחס בין שני המבנים באופן המתאים וודא בונה הן תחת מקדם אותו, כדי לוודא שאף אחד היזם לא יהיה מחוץ להתחרות השני.

<ol><li>Klein, T. M., Fromm, M., Weissinger, A., Tomes, D., Schaaf, S., Sletten, M., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+foreign+genes+into+intact+maize+cells+with+high-velocity+microprojectiles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity microprojectiles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4305-4309 (1988).</li>
<li>Wellmann, H., Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+biolistic+transfection+of+brain+slices+and+dissociated+cultured+neurons+with+a+hand-held+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for biolistic transfection of brain slices and dissociated cultured neurons with a hand-held gene gun.</a> J. Neurosci. Methods. 92, 55-64 (1999).</li>
<li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+STKE%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of neurons.</a> Sci. STKE. 51, 1-13 (2000).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
</ol>

Transfection Biolistic הוא אמצעי פיזי של transfecting תאים באמצעות הפגזה של רקמה חיה גבוהה עם ה-DNA מהירות החלקיקים מצופה זהב. ב העברת גנים בתיווך חלקיקים, תאים transfected כללי התוצאה כאשר הכדור מגיע לנוח בגרעין. בעוד רבים transfection שיטות שונות קיימות, כגון, microinjection lipofection, electroporation סידן פוספט, transfection ו transfection ויראלי, transfection biolistic יכולים להציע עבודה פחות אינטנסיבית, חלופה יעילה transfecting תאים שאינם transfected בקלות באמצעות שיטות אלה אחרים. למעשה, זה פותח לראשונה כטכניקה להעברת גנים בצמחים מאז נוכחות של התא הקיר עשוי transfection קשה בשיטות קודמות 1. באופן דומה, biolistics צברה פופולריות בתחום הנוירוביולוגיה מאז הפוסט mitotic הנוירונים קשה לשמצה transfect 2,3. בפרט, זוכה להכרה רחבה כטכניקה העיקרון לשמש בניסויים שמטרתם להעריך מורפולוגיה קנס של נוירונים בודדים פרוסות המוח ללא פגע. השיטות שתוארו כאן לספק הסבר מפורט ומקיף של כיצד לבצע transfection biolistic של פרוסות המוח בתרבית באמצעות כף יד גן ירייה (הליוס Gun ג&#39;ין המערכת; Bio-Rad). Transfection Biolistic הפכה השיטה המועדפת transfecting נוירונים בתרבית פרוסה משום שהוא מאפשר transfection של מספר מועט של תאים פרוסה ברחבי המוח. בדרך זו, נוירונים בודדים יכולים להיבחן במנותק. מאז הטכניקה הזו הוא גם מתאים במיוחד עבור transfecting הנוירונים במוח פרוסה, הוא משמש לעיתים קרובות בשילוב עם מיקרוסקופיה 2-פוטון, מאז להדמיה 2-פוטון מאפשר עירור של תאים שכותרתו fluorescently עמוק בתוך רקמת פיזור אור 4. אכן תמונות בהגדלה גדולה של נוירונים פירמידליים יחיד שהוצגו ברחבי וידאו זה נלכדו באמצעות אישית בנוי 2-פוטון מיקרוסקופ סריקת לייזר. ב transfection biolistic המסקנה היא אמצעי יעיל transfecting תאים בודדים בתוך ההקשר של צפיפות גבוהה של תאים המקיפים, וככזה הוכיחה מאוד שימושי עבור fluorescently תיוג נוירונים בודדים בתרבות פרוסה עצביים.

אמנם יש לנו את כל המוצרים המפורטים בנפרד, הוא חסכוני יותר לרכוש &quot;הליוס Gene-Gun מערכת&quot;, הכולל את כל מוצרי Bio-Rad המפורטים לעיל (חתול # 165-2431).

הכנת כדורי אקדח ין transfection biolistic של נוירונים תרבות slice

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Transfection Biolistic הוא אמצעי פיזי של transfecting תאים על ידי מפציצים גבוהה רקמה עם דנ&quot;א חלקיקים מהירות מצופה. אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור transfection biolistic של פרוסות בהיפוקמפוס חולדה, החל בהכנה הראשונית של ה-DNA כדורים מצופים לירי הסופי של תרבויות פרוסה organotypic באמצעות אקדח גנים. אקדח transfection Gene הוא אמצעי יעיל וקל של transfecting נוירונים שימושית במיוחד fluorescently תיוג חלק קטן של תאים ורקמות פרוסה. בסרטון הזה, אנחנו הראשונים מתאר את הצעדים הנדרשים כדי חלקיקי זהב מעיל עם ה-DNA. אנחנו הבא להדגים כיצד לקו הפנימי של צינורות פלסטיק עם כדורי זהב / DNA, כיצד לחתוך את צינורות כדי להשיג את מחסניות פלסטיק עבור טעינת אקדח לתוך הגן. לבסוף, אנו מבצעים transfection biolistic של תרבויות עכברוש בהיפוקמפוס פרוסה, הוכחת טיפול של ביו רד הליוס אקדח גן, ומציעים ייעוץ ירי צרות לקבל פרוסות רקמה בריאה transfected בצורה אופטימלית.

אנו מתארים שיטה להכנת דנ&quot;א כדורים מצופים זהב להדגים את השימוש בכדורים כאלה biolistically transfect נוירונים בהיפוקמפוס פרוסות תרבותי.

הכנת כדורי אקדח ין transfection Biolistic של נוירונים תרבות Slice

טרנספקציה ביוליסטית היא אמצעי פיזי לטרנספקציית תאים על ידי הפצצת רקמה בחלקיקים מצופים ב-DNA במהירות גבוהה. אנו מספקים...

טרנספקציה באמצעות "רובה גנים" (Gene gun) היא אמצעי פיזי להחדרת חומר גנטי לתאים על ידי הפצצת רקמה בחלקיקים מצופים ב-DNA במהירות גבוהה. טכניקה זו היא אמצעי יעיל וקל לטרנספקציה של נוירונים, והיא שימושית במיוחד לטרנספקציה של מספר קטן של תאים בלבד בתוך פרוסת רקמה. לדוגמה, במחקרים של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית השואפים לבחון מורפולוגיה נוירונלית בפרוסה שלמה.טרנספקציית Bic מאפשרת הדמיה של נוירונים בודדים על רקע נקי של תאים שלא עברו טרנספקציה. בסרטון זה, נדגים שיטה להכנת תחרושמם (bullets) של אקדח גנים מצופים ב-DNA, ולאחר מכן ביצוע טרנספקציית Bic על תרביות של פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות. שלום, אני ג'ורג'יה וודס.אני סטודנט לתואר מתקדם במעבדתה של ד"ר Karen Zito באוניברסיטת קליפורניה ב-Davis. היום אדגים כיצד להכין "קליעים" מצופים ב-DNA וכיצד לבצע ביסמינציה (Bic transfection) לפרוסות היפוקמפוס של חולדה. השלבים הבסיסיים העומדים בבסיס הביסמינציה הם: ראשית, ציפוי חלקיקי זהב ב-DNA המיועד לטרנספקציה, ושנית, ציפוי הפנים של צינורית הפלסטיק בחלקיקי זהב אלו.חתוך את הפיתוח למחסניות להטענה ברובה הגנים ורבעית, הזרק לרקמה המיועדת לטרנספקציה. אז בואו נתחיל. לפני שנוכל לבצע את הטרנספקציה, עלינו תחילה להכין את התחמושים המצופים ב-DNA.תהליך זה יכלול ציפוי של חלקיקי זהב בגודל 1.6 מיקרון ב-DNA הפלסמיד המיועד לטרנספקציה. במהלך הירי, כל חלקיק זהב בודד ישמש כ"קליע" שיחדור לתא ויוביל לטרנספקציה. לכן, ראשית עלינו להכין את ה-DNA לטרנספקציה.באופן אידיאלי, מומלץ להשתמש בפחות מ-50 micrograms של DNA עבור כל סט של "bullets" בנפח כולל של 50 microliters של מים. יש לקחת בחשבון כי את הכמות המדויקת של ה-DNA שיש להשתמש בה יש לקבוע באופן אמפירי עבור כל קונסטרקט, בהתבסס על השגת רמת הביטוי האופטימלית. כעת, לאחר שיש לנו את המכסה (aliquot) של ה-DNA, עלינו להוסיף את ה-sperming לחבבי הזהב.הוסיפו לשמונה mg של זהב שנשקלו מראש, מאה µL של זרע, ערבבו והפעילו סוניקציה למשך כ-20 שניות. זהו הזרע.מיין (Meine) הוא פולי-אמין המטעין בחיוביות את מובילי הזהב, כך ש-DNA בעל מטען שלילי יקיים אינטראקציה עם המתכת בעלת המטען החיובי. לאחר השלב ה-22, הוסף 50 µL מתמיסת DNA במים לזהב. לאחר הוספת ה-DNA לחרוזים, בצע ערבוב במערבל (vortex) תוך כדי הוספה של 100 µL סידן כלוריד בטיפות; סידן כלוריד גורם לשקיעת ה-DNA.לאחר ערבוב קצר במכשיר vortex, יש להניח לתמיסה לשקוע במשך 10 דקות. לאחר השקיעה של 10 דקות, יש לסובב את ה-DNA והזהב במהירות מקסימלית למשך 30 שניות בצנטריפוגה שולחנית. לאחר הסבב המהיר, יש להסיר בעזרת פיפט את מרבית הנוזל העליון (supernatant), אך יש להימנע משאיבת משקע הזהב. בשלב זה, אני מסיר כל DNA שלא שקע על הזהב.לאחר מכן שוטפים את חלקיקי הזהב ב-1 mL של אתנול טרי ומבצעים סוניקציה קצרה. כאשר ה-DNA שוקע, הוא נוטה לגרום לחלקיקי הזהב להיצמד; סוניקציה קלה מפרקת את גושי הזהב הללו. יש להיזהר לא לגרום לשבירה של ה-DNA על ידי סוניקציה ממושכת מדי.סובבים שוב את כדוריות הזהב בצנטריפוגה ומסירים את האתנול באמצעות פיפטינג. חוזרים על שטיפת האתנול פעמיים נוספות. לאחר שטיפת האתנול השלישית, מוסיפים 200 µL של תמיסת פולי ויניל פירון או תמיסת PVP מדוללת ומבצעים סוניקציה.העבירו במהירות את הזהב המצופה למבחנה קונית של 15 מ"ל המכילה כבר 200 µL של תמיסת PVP מדוללת. PVP הוא ממס שיגרום לחלקיקי הזהב להיצמד לצינור הפלסטיק שבו נעשה שימוש. בשלב הבא, הסירו שאריות של חרוזי זהב שנותרו במבחנה האפי (epi tube) על ידי הוספת 200 µL של PVP למבחנה האפי.לאחר מכן, בצעו סינון קצר והעבירו את התוכן למבחנה קונית של 15 מיליליטר. חזרו על פעולה זו עד שכל הזהב הועבר למבחנה הקונית של 15 מיליליטר. העבירו את תמיסת ה-PVP שנותרה כך שהזהב יהיה כעת תלוי בתמיסת PVP-אתנול של 3.2 מיליליטר.כעת אנו מוכנים לצפות את צינור הפלסטיק שישמש למכיל של קליעי רובה הגנים בעת טעינתם לרובה הגנים. כעת, כאשר הזהב מצופה ב-DNA, עלינו לצפות את פנים צינור הפלסטיק בחלקיקי הזהב. צינור פלסטיק זה, המצופה בזהב, הוא הרכיב שייטען בפועל לתוך מבחנת רובה הגנים.להתחלה, חתכו חתיכת צינור כך שתבלוט כ-two inches מעבר לטבעת ה-O. לאחר שהצינור הונח בתחנת הכנת הצינורות, סובבו את שסתומי הלחץ כך שמד הזרימה יראה כ-0.4. חנקן מספק סביבה נטולת מים לייבוש הצינור; ייבשו את הצינור למשך כ-20 דקות.מומלץ לבצע את שלב הייבוש זה בזמן ציפוי כדורי הזהב ב-DNA כפי שהודגם בשלב הקודם. באופן זה, הפיתול יהיה יבש ויהיה מוכן לציפוי עם סיום הפעולה. הכנת חרוזי הזהב כעת, לאחר שהפיתול יבש והזהב צופה ב-DNA.כבה את תחנת ה-N two לפני מילוי הפחית בתמיסת ה-gold PVP שלך, הסר את הפחית היבשה מהתחנה וחבר אותה למזרק של 10 mil לפני שאיבת ה-PVP וה-gold אל תוך הפחית. נער את התמיסה היטב ושאוב אותה מיד אל תוך הפחית היבשה, תוך הימנעות מהיווצרות בועות. כמו כן, הקפד לא לשאוב את התמיסה לתוך המזרק.כעת, כאשר הפרוזדור מלא בתמיסת PVP Gold, החזירו בזהירות את הפרוזדור לתחנה N שתיים. הניחו לתמיסה להשקיע במשך חמש דקות כאשר המזרק מחובר, כדי שחלקיקי הזהב ישקיעו בתחתית הפרוזדור. סמנו את קצות הפרוזדור בנקודה שבה התמיסה שקעה.לאחר שהתמיסה שוקעת, ייראה פס של זהב בתחתית הפביה באמצעות המזרק המצורף. שאבו את הנוזל העליון (supernatant) באיטיות רבה, תוך הקפדה לא לגרום לשטיפה לאחור בעת ניתוק הפביה. כעת יש לסובב ולייבש את הפביה על מנת להבטיח הצמדה אחידה של הזהב לאורך כל פנים הפביה.ראשית, סובב את הפחית ב-90 מעלות. המתן שתי שניות להתייצבות. כעת סובב 180 מעלות נוספות, והמתן שתי שניות נוספות להתייצבות.סובבו למשך חמש שניות ולבסוף הפעילו את ה-N two כך שהתחנה תקרא בין 0.4 ל-0.5, והמשיכו לסובב בזמן שהצינור מתייבש למשך חמש דקות. כעת, לאחר שחלפו חמש דקות והזהב יבש, עלינו לחתוך את הצינור לקרטריג'ים שניתן להטעין לתוך תותח הגנים. כעת אחתוך את הצינור למקטעים של כחצי אינץ' כדי ליצור את התאים שיהיו בגודל המתאים להטענה לתוך הצילינדר של תותח הגנים.על מנת לאסוף את התארים, הנח את סימולציית מרה של כלב מתחת לחותך, חתוך את הפחית בסימונים, וחתוך את הפחית בעזרת תער נקי. הנח את הפחית בקוצץ הפחית כדי לחתוך אורך מתאים. פשוט הזן את הפחית קדימה עד שתרגיש התנגדות ואז חתוך.לאחר שהצינור נחתך ונאסף לבקבוק המ scintillation, יש להניח לבקבוק ה-scintillation כדור ייבוש. הכדורים יעילים למשך עד שישה חודשים, אך לאחר חודשיים עד שלושה עשוי להתרחש ירידה ביעילות הטרנספקציה. לכן, מומלץ לסמן את הבקבוק בשם המבנה ובתאריך.ניתן להשתמש בכדורים מיד לאחר הכנתם או לאחסנם בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. אם משתמשים בכדורים שאוחסנו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, יש להמתין שכוורית התמיס תגיע לטמפרטורת החדר במשך כ-15 דקות לפני הפתיחה, וזאת כדי למנוע מהכדורים לספוג לחות. כעת אנו מוכנים להשריץ את כדורי ה-DNA באמצעות פגנ-ג'ין (gene gun).כעת, לאחר שהתחה שהוכנה, אני מוכן לבצע את התעתוק הגנטי של התאים. אשתמש ברובה גנים מסוג BioRad Helios ואפציץ פרוסות היפוקמפוס של חולדה שהוincubated למשך חמישה ימים מרגע הניתוח. רובה הגנים יחובר למכל גז הליום.בעת ירי של הרובה, פרץ קצר של לחץ מהמכל יאיץ את חלקיקי הזהב בפרוסה. באופן כללי, כאשר חלקיק זהב נטמע בגרעין התא, תא זה יהפוך לטרנספקטיבי.מכיוון שאני מבצע טרנספקציה של פרוסות תרבית, אני משתמש בטכניקה סטרילית למדי לאורך כל תהליך הטרנספקציה כדי למנוע זיהום. לאחר שהמחסניות התחממו לטמפרטורת החדר, פתח את בקבוק הסימולציה והנח את המחסניות הפלסטיקיות המצופות זהב לתוך מחזיק המחסניות. לאחר מכן, הנח את מחזיק המחסניות לתוך תותח הגנים, תוך דחיפה תחילה של נעילת הגליל לאחור.כעת יש לחבר את תודת הקנה לאקדח. ראשית, ודאו שטבעת ה-O-ring נמצאת בתודת הקנה ושרשת הדיפוזר מהודקת. הרשת משמשת לפיזור הלחץ מהתודה ומובילה לה sprayed של הזהב, לצורך פיזור אחיד יותר של הזהב בבאר.הברגו את תודעת הקנה (barrel liner) עד הסוף אל תוך תותח הגנים. בעת ירי של שני מבנים (constructs) שונים, ניתן להטעין את שני סטים של הקליעים לאותו מחזיק מחסנית, אך יש להחליף את תודעת הקנה ואת המסך בין המבנים השונים. תותח הגנים מוכן כעת לחיבור למקור ההליום.חברו את תותח הגנים לצינור המחובר למכל גז ההליום. הוא אמור להינעל במקומו; הגבירו את הלחץ במכל ל-180 PSI. התותח כעת מוכן לירי, אך ראשית, זכרו לענוד הגנה על השמיעה, וכדי להסיר אבק או פסולת מרשת הדיפוזור, בצעו ירי ללא חומר (blank).ראשית, לחצו על כפתור מנגנון הבטיחות עד שהאקדח ישמיע צפצוף ומשכו את ההדק. כעת אנו מוכנים להקרין את הפרוסה. לאחר ביצוע יריית ניסיון, הוציאו את הפרוסות מהאינקובטור.במהלך דיסקציות ההיפוקמפוס, אנו מניחים ארבעה פרוסות לכל באר ומסדרים אותן כך שיהוו את הפינות של ריבוע בן שני סנטימטרים סמוך למרכז הממברנה. יש להקרין כל באר באמצעות מסך המפיץ (diffuser screen) במרחק של כחצי אינץ' עד אינץ' אחד מהפרוסה. בדרך כלל ניתן לבחון תאים שעברו טרנספקציה בטווח של יום אחד עד חמישה ימים, בהתאם למבנה (construct).לאחר שכל הבארות נורו, כבה את הגז ושחרר את הלחץ לפני ניתוק האקדח מצינור ההליום. הוצא את מחסניות התחמושת ואת התפטפות המשומשות. הברג החוצה את התשתית של הקנה; ניתן לנקות את המחסניות, תשתיות הקנה והמסננים על ידי הנחתם באמבט מים עם סבון וביצוע ניקוי אולטרסוני למשך 20 דקות, שטיפה יסודית במים, השריה ב-70% ethanol למשך שעה, ולאחר מכן הנחתם על נייר סופג למשך לילה.ניתן להשתמש שוב במחסניות ובמסננים נקיים בהעברות גנים (transfection) ביוטיות עוקבות. כעת נבחן חלק מתוצאות ההעברה. אפילו עבור הכנה סטנדרטית של פרוסות היפוקמפוס, עשוי להופיע טווח רחב למדי של יעילויות העברה, בהתאם ל"קליעים" (bullets) ולפרוסות.באופן כללי, רצוי להשיג נצילות טרנספקציה נמוכה יחסית כדי לקבל נוירונים שעברו טרנספקציה ומבודדים היטב. בנוסף, כאשר תאים רבים מדי עוברים טרנספקציה, הבריאות הכללית של הפרוסה נפגעת, גם בתנאים אופטימליים. בדרך כלל יש פחות מ-20 תאים לכל פרוסה, אך לעיתים קרובות בפרוסות אחרות באותה באר יהיו תאים רבים יותר.בפרוסות שעברו טרנספקציה ובפרוסות אחרות יהיו פחות תאים. אי-עקביויות ביעילות הטרנספקציה בין הפרוסות נובעות בדרך כלל מכך שמיקום הפרוסות ביחס לחבית לא היה סימטרי, או שהציפוי של הזהב סביב הצינור לא היה אחיד אלא היה מרוכז בצד אחד. אם תאים רבים מדי עוברי טרנספקציה, נסו להגדיל את מרחק הירי מהדגימה, להפחית את לחץ הירי או להפחית את כמות הזהב המשמשת להכנת הכדורים.כאן ניתן לראות דוגמה מצוינת של נוירון פאראמטלי ב-ca1 שעבר טרנספקציה. בתא ספציפי זה, ניתן לראות קליע זהב מוטמע בתוך התא. להלן מבט מקרוב יותר על נוירון שעבר טרנספקציה. ב-ca1, לעיתים גירוי חשמלי עלול להוביל לפרוסות לא בריאות.לעיתים קרובות, פעימות הלחץ גורמות להיווצרות פרוסות לא בריאות. מערכת תותח הגנים Helios מגיעה עם מפיץ שמרכזו כולל צלב מתכת. אנו מסירים את צלב המתכת הפנימי ובמקומו משתמשים ברשת מתכת.גזרנו פשוט את הרשת כך שתהיה גדולה מעט מקצה תמיכת החבית (barrel liner) וצמצמנו אותה בין קצה תמיכת החבית לבין המפזר (diffuser) הגזור. מצאנו כי הדבר משפר את חיוניות הפרוסות. בנוסף, תנאי הירי האופטימליים ישתנו בהתאם להכנה הניסויית; כדי להגיע לאופטימיזציה עבור הכנות ניסיויות שונות, שנו את הלחץ במכל ההליום ואת מרחק הירי מהדגימה.לבסוף, במקרה שתרצו להשתמש במיקרו-חלקיקים (bullets) עם שני מבנים שונים עבור טרנספקציה כפולה, ודאו ששני המבנים נמצאים תחת אותו מקדם (promoter). בצורה זו, מקדם אחד לא יגבור על השני. כעת הצגתי בפניכם כיצד להכין מיקרו-חלקיקים עבור Gene Gun וכיצד לבצע טרנספקציה לפרוסות של ההיפוקמפוס באמצעות טרנספקציית BIC.זוהי שיטה עוצמתית ביותר לביצוע מחקרים מורפולוגיים על נוירונים בודדים שניתן לדגם בבידוד. זהו כל הדבר. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

preparation-gene-gun-bullets-biolistic-transfection-neurons-slice

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ג&#39;ין ירייה transfection של נוירונים בהיפוקמפוס

מאמר זה מדגים את לנתיחה ו הדגירה של הרשתית ארנב החלקיקים בתיווך העברת גנים של פלסמידים או קידוד ה-GFP מגוון רחב של סמנים subcellular לתאי הגנגליון ברשתית.

תרבות Organotypic של הרשתית הארנב למבוגרים

הזרקה ישירה של intranuclear cDNA היא טכניקה יעילה transfection שלאחר mitotic תאים. שיטה זו מספקת רמות גבוהות של ביטוי חלבון מן Heterologous בונה cDNA בודדות או מרובות ומאפשר תפקוד החלבון להיחקר בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית עם מגוון רחב של מבחני תא בודד.

Microinjection Intranuclear של דנ&quot;א לתוך ניתק נוירונים היונקים למבוגרים

זהו פרוטוקול להכין ולתחזק הכנה פרוסה neocortical בתרבות organotypic לצורך ביצוע הקלטות חשמל עצב פירמידליים.

הקלטה נייד שלמים מן ההכנה פורסים Organotypic של הניאוקורטקס

לבצע הערכה מהירה של הפונקציה של הגנים בהתפתחות קליפת המוח, אנו מתארים שיטות...

שיטות לימוד המורפוגנזה העצבית:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi electroporation בקליפת עובריים מוחין Murine

מקור: Keener, D. G., et al. אלקטרופורציה של תא בודד על פני תרביות פרוסות אורגנוטיפיות שונות של נוירונים מעוררים ומעכבים ספציפיים לכיתה של עכבר. J. Vis. Exp. (2020).סרטון זה מדגים את התהליך של אלקטרופורציה של תא בודד להחדרת DNA פלסמיד לתאי עצב בתוך תרביות פרוסות היפוקמפוס של עכברים. ההליך כולל מיקום מדויק של פיפטה, התאמות לחץ ופולסים של אלקטרופורציה כדי לחלחל באופן זמני את הממברנה העצבית, מה שמקל על העברת גנים. לאחר האלקטרופורציה, הפרוסה מודגרת כדי לאפשר ביטוי של הגן המבוקש.

ביטוי גנים באמצעות אלקטרופורציה של תא בודד בתרביות פרוסות היפוקמפוס של עכברים

סרטון זה מדגים את הפרוטוקול לאלקטרופורציה חד-תאית של גנים הן בתאי עצב מעוררים והן בתאי עצב מעכבים במגוון תרביות פרוסות היפוקמפוס במבחנה. הטכניקה שימושית לבחינת תפקודים מולקולריים ופיזיולוגיים ספציפיים של נוירונים, כולל מנגנונים אוטונומיים של תאים ואינטראקציות בין חלבונים טרנססינפטיים.

אלקטרופורציה של תא בודד בתרביות פרוסות מוח אורגנוטיפיות: טכניקה במבחנה להעברת פלסמידים בתוך נוירונים ממוקדים בפרוסות היפוקמפוס במוח

מקור: Denaxa, M., el al., השתלת אבות של אינטרנוירונים קליפתיים מהונדסים כימוגנטית לתוך מוחות עכברים מוקדמים לאחר הלידה. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את ההליך להזרקת וקטור פלסמיד הנושא את הגן המעניין לאבות בין-נוירוניים בפרוסת מוח עוברית, ואחריו אלקטרופורציה לכניסת פלסמיד וביטוי גנים. אבות אבות מותאמים אלה יכולים לשמש מאוחר יותר לטיפול בהפרעות מוחיות.

העברת גנים בסיוע אלקטרופורציה משובצת אגרוז באבות אבות בין-עצביים בקליפת המוח של עכברים

שיפורים אחרונים בתכשירים אורגנוטיפיים של פרוסות מוח אפשרו את ניצולם ליישומים ביוטכנולוגיים. פרוסות אורגנוטיפיות שומרות על מאפיינים מבניים מקומיים של ביולוגיה in vivo, כולל קשרים סינפטיים פונקציונליים. כאן אנו מציגים שיטת אספקה ביוליסטית רגיוסלקטיבית לתיוג ומניפולציה גנטית של פרוסות אלה.

Regioselective Biolistic המיקוד בOrganotypic פרוסות המוח באמצעות אקדח ג&#39;ין השתנה

מוצג כאן פרוטוקול לאלקטרופורציה חד-תאית שיכולה לספק גנים הן בתאי עצב מעוררים והן בתאי עצב מעכבים על פני מגוון גילאים של תרבות פרוסות היפוקמפוס במבחנה. הגישה שלנו מספקת ביטוי מדויק ויעיל של גנים בתאים בודדים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לבחון פונקציות תאיות אוטונומיות ובין תאיות.

אלקטרופורציה חד-תאית על פני תרבות פרוסה אורגנוטיפית שונה של נוירונים מעכבים היפוקמפוס ומעמד ספציפיים

למדו הכנת כדורי זהב מצופי DNA לטרנספקציה ביוליסטית של נוירונים בפרוסות היפוקמפוס מתורבתות. שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה יעילה של תאים בודדים ברקע נקי לחקר מורפולוגיה נוירונלית.

הכנת כדורי אקדח ין transfection Biolistic של נוירונים תרבות Slice

גלה סרטונים נוספים