Name: טכניקות Patch-Clamp לניתוח שלפוחית אנדוליזוזומלית בודדת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: למד טכניקת פאץ'-קלאמפ אנדוליזוזומלית ידנית למדידת פעילות ערוצי יונים בקומפורטמנטים תוך-תאיים. שיטה זו מאפשרת למדענים לחקור ערוצים שלא נגישים באלקטרופיזיולוגיה מסורתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Cullen, P. J., Steinberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+degrade+or+not+to+degrade%3A+mechanisms+and+significance+of+endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (11), 679-696 (2018).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Kumar, P., Kumar, D., Jha, S. K., Jha, N. K., Ambasta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels+in+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Protein+Chem+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Ion channels in neurological disorders.</a> Adv Protein Chem Struct Biol. 103, 97-136 (2016).</li>
<li>Brailoiu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ancestral+deuterostome+family+of+two-pore+channels+mediates+nicotinic+acid+adenine+dinucleotide+phosphate-dependent+calcium+release+from+acidic+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">An ancestral deuterostome family of two-pore channels mediates nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate-dependent calcium release from acidic organelles.</a> J Biol Chem. 285 (5), 2897-2901 (2010).</li>
<li>Pitt, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TPC2+is+a+novel+NAADP-sensitive+Ca2%2B+release+channel%2C+operating+as+a+dual+sensor+of+luminal+pH+and+Ca2%2B%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">TPC2 is a novel NAADP-sensitive Ca2+ release channel, operating as a dual sensor of luminal pH and Ca2+.</a> J Biol Chem. 285 (45), 35039-35046 (2010).</li>
<li>Gerndt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agonist-mediated+switching+of+ion+selectivity+in+TPC2+differentially+promotes+lysosomal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Agonist-mediated switching of ion selectivity in TPC2 differentially promotes lysosomal function.</a> Elife. 9, e54712(2020).</li>
<li>She, J., Guo, J., Jiang, Y. Structure and function of plant and mammalian TPC channels. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShe%2C+J+%22Endolysosomal+voltage-dependent+cation+channels%22">Endolysosomal voltage-dependent cation channels</a>. Wahl-Schott, C., Biel, M. , Springer. Cham. 155-180 (2023).</li>
<li>Hu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease-risk+protein+TMEM175+is+a+proton-activated+proton+channel+in+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease-risk protein TMEM175 is a proton-activated proton channel in lysosomes.</a> Cell. 185 (13), 2292-2308.e20 (2022).</li>
<li>Grimm, C., Bartel, K., Vollmar, A. M., Biel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endolysosomal+cation+channels+and+cancer%3A+A+link+with+great+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Endolysosomal cation channels and cancer: A link with great potential.</a> Pharmaceuticals (Basel). 11 (1), 4(2018).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Ion+and+molecule+transport+in+lysosomes%22">Ion and molecule transport in lysosomes</a>. Gasnier, B., Zhu, M. X. , 1st ed, CRC Press. (2020).</li>
<li>Hernández-Ochoa, E. O., Schneider, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+clamp+methods+for+the+study+of+membrane+currents+and+SR+Ca2%2B+release+in+adult+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Voltage clamp methods for the study of membrane currents and SR Ca2+ release in adult skeletal muscle fibres.</a> Prog Biophys Mol Biol. 108 (3), 98-118 (2012).</li>
<li>Chen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+technique+to+characterize+ion+channels+in+enlarged+individual+endolysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp technique to characterize ion channels in enlarged individual endolysosomes.</a> Nat Protoc. 12 (8), 1639-1658 (2017).</li>
<li>Chen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+for+early+endosome-specific+patch+clamping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Small molecules for early endosome-specific patch clamping.</a> Cell Chem Biol. 24 (7), 907-916.e4 (2017).</li>
<li>Cang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+regulates+lysosomal+ATP-sensitive+two-pore+Na%2B+channels+to+adapt+to+metabolic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mTOR regulates lysosomal ATP-sensitive two-pore Na+ channels to adapt to metabolic state.</a> Cell. 152 (4), 778-790 (2013).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>מכשיר סאטר</td> <td>זכוכית בורוסיליקט</td><td>BF150-75-10</td><td>OD: 1.5 מ"מ, מזהה 0.75 מ"מ אורך 10 ס"מ, עם נימה</td></tr><tr><td>Digidata 1140A</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך IX73</td><td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>דגם P-97 חולץ מיקרופיפטה</td><td>מכשיר</td><td></td><td></td>סאטר</tr><tr><td>MPC-200</td><td>מכשיר</td><td></td><td></td> סאטר</tr><tr><td>MultiClamp 700B</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>POLISHER</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תא שחרור מהיר</td><td>מכשירי וורנר</td><td>641943</td><td>QR-40LP, עבור 25 מ"מ Coverslips</td></tr></tbody></table>

טכניקות patch-clamp לניתוח שלפוחית אנדוליזוזומלית בודדת

Patch-Clamp Techniques for Single Endolysosomal Vesicle Analysis

להלן מתאר את הצורות הנוכחיות שנצפו במהלך ניסויי מהדק טלאי אנדוליזומלי. אם הצורה הנוכחית אינה כצפוי, זה יכול להיות בגלל מגע לקוי או דליפה. מגע לקוי עלול להתרחש אם אלקטרודת הייחוס אינה במגע מלא עם תמיסת האמבטיה או אם אלקטרודת הפיפטה עומדת להישבר. דליפה יכולה להתרחש אם יש פער בין החדר לכיסוי המאפשר לנוזל לזרום אל עדשת האובייקט או על הבמה; תמיסת פיפטה רבה מדי או קטנה מדי עלולה גם לגרום לחריגות כאלה.
החדרת מחט לתמיסה/מגע מחט עם משטח התא/ZAP במהלך הקמת המצב המחובר לליזוזום (היווצ...

טכניקות Patch-Clamp לניתוח שלפוחית אנדוליזוזומלית בודדת

Endolysosomal ion channels are critical for endolysosomal ion and pH homeostasis, membrane potential regulation, and vesicle trafficking. However, ...

patch-clamp-techniques-for-single-endolysosomal-vesicle-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה לבודד את שלפוחית ​​submitochondrial מועשרת במתחמי ה-ATP synthase F1FO ממוח חולדה מתוארת. שלפוחית ​​אלה מאפשרים מחקר של הפעילות של F1FO ATPase המורכב והאפנון שלה תוך שימוש בטכניקה של הקלטת תיקון מהדק.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; הכנת שלפוחיות ATPase וטכניקה לביצוע הקלטות מהדק תיקון של קרום שלפוחית ​​Submitochondrial

בנייה מחדש של חלבונים בממברנה פונקציונליים ליפוזומים ענקים של הרכב מוגדר היא גישה רב עוצמה בשילוב עם electrophysiology תיקון מהדק. עם זאת, ייצור liposome ענק קונבנציונלי עשוי להיות בקנה אחד עם יציבות חלבון. אנו מתארים פרוטוקולים לייצור ליפוזומים ענקים משומנים טהורים או ליפוזומים קטן המכיל תעלות יונים.

הכנת Liposome ענקית הדמיה ותיקון מהדק Electrophysiology

אנדוציטוזיס בתיווך קלת'רין, תהליך מהיר ודינמי ביותר שמפנים חלבונים רבים, כולל קולטני איתות. הפרוטוקול המתואר כאן מדמיין ישירות את הקינטיקה של אירועים אנדוציטיים בודדים. זה חיוני להבנת האופן שבו חברי הליבה של המנגנון האנדוציטי מתאמים זה עם זה, וכיצד מטען החלבון משפיע על תהליך זה.

חזותי אנדוציטוזה בתיווך clathrin של רצפטורים מצמידים חלבון G בהחלטה חד אירוע באמצעות TIRF מיקרוסקופית

הכינון מחדש של החלבון הטרנסממברני, KvAP, לתוך שלפוחית ​​unilamellar ענקית (GUVs) הוא הוכיח לשתי שיטות התייבשות-החזרת נוזלים - electroformation, ונפיחות בסיוע ג '. בשני השיטות, שלפוחית ​​unilamellar קטנה המכילה החלבון הם התמזגו יחד כדי ליצור GUVs כי אז יכול להיות שנחקר על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואלקטרופיזיולוגיה תיקון מהדק.

כינונה מחדש של חלבון טראנסממברנלי, יון ערוץ מתח מגודרת, KvAP, לענק Unilamellar שלפוחית ​​למיקרוסקופי וצמד תיקון ללימודים

פרוטאוליפוזומים משמשים לחקר תעלות מטוהרות וטרנספורטרים שהוקמו מחדש בסביבה ביוכימית מוגדרת היטב. מודגם הליך ניסיוני למדידת פליטה בתיווך חלבונים אלה. מתוארים השלבים להכנת פרוטאוליפוסומים, ביצוע ההקלטות וניתוח נתונים כדי לקבוע כמותית את התכונות הפונקציונליות של החלבון המשוחזר.

Proteoliposome מבוסס הזרימה Assay כדי לקבוע מאפייני מולקולה בודדת של Cl<sup-&gt;</sup&gt; ערוצים ומסועים

כימות מדויק של אירועי סחר בשלפוחית מספק לעתים קרובות תובנות מפתח לגבי תפקידים של חלבונים ספציפיים והשפעות של מוטציות. מאמר זה מציג שיטות לשימוש ב-pHluorin סופר-אקליפטי, וריאנט GFP רגיש ל-pH, ככלי לכימות אירועים אנדוציטיים בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותי וציטומטריית זרימה.

יישומים של pHluorin עבור כמותי, קינטי וניתוח תפוקה גבוהה של אנדוציטוזה שמרים הנצה

שלפוחית סינפטית אנדוציטוזה מזוהה על ידי מיקרוסקופ אור של pHluorin התמזגו עם שלפוחית סינפטית חלבונים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים של ספיגת שלפוחית.

מדידת אנדוציטוזה שלפוחית סינפטית של נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית

ליפוזומים המכיל חומרים פעילי שטח יחיד-שרשרת, בעיקר חומצות שומן, התערוכה מאפיינים ברורים לעומת אלה diacylphospholipids המכיל בשל התכונות הכימיות ייחודי של חומרים פעילי שטח שרשרת אחת. כאן נתאר טכניקות עבור הכנה, טיהור, השימוש ליפוזומים מורכבת באופן חלקי או שלם של אלה חומרים פעילי שטח.

הכנה, טיהור, השימוש ליפוזומים המכילים חומצת שומן

כאן, אנו מציגים עבור היווצרות ליפיד bilayers באמצעות שיטת bilayer בועה קשר פרוטוקול. בועת מים הוא התפוצץ לתוך הממס האורגני, לפיה טפט נוצר ב הממשק מים-שמן. פיפטות שני יפגעו כדי לעגן את הבועות כדי ליצור bilayer.

השומנים Bilayer ניסויים עם בועה קשר Bilayers עבור תיקון-Clampers

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לסימון שלטי דם חוץ-תאיים שמקורם בטסיות דם כדי לפקח על נדידתם וקליטתם בגזירי סחוס המשמשים כמודל לדלקת מפרקים ניוונית.

תיוג של שלל חוץ-תאי לניטור הגירה וספיגה של סחוס

למד טכניקת פאץ'-קלאמפ אנדוליזוזומלית ידנית למדידת פעילות ערוצי יונים בקומפורטמנטים תוך-תאיים. שיטה זו מאפשרת למדענים לחקור ערוצים שלא נגישים באלקטרופיזיולוגיה מסורתית.

טכניקות Patch-Clamp לניתוח שלפוחית אנדוליזוזומלית בודדת

גלה סרטונים נוספים