הקרנה במבחנה מבוססת LED להערכת מולקולות הניתנות להפעלה פוטודינמית בהפעלה פוטודינמית של חיידקים
24 בינואר 2025
פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה וחסכונית להערכת היעילות של רגישים לאור פוטו-רגישים פוטנציאליים באינאקטיבציה פוטודינמית אנטיבקטריאלית (aPDI), תוך שימוש בפורמט צלחת של 96 בארות בשילוב עם מקור אור פאנל LED. גישה זו מאפשרת בדיקה בו-זמנית של תנאי ניסוי מרובים, כולל ריכוזים שונים, תרכובות וזני חיידקים.
המחקר שלי מתמקד בחקר מולקולות שונות ממשפחת תרכובות הפלביליום, הן טבעיות והן סינתטיות, עם עניין מרכזי בחקר הפעילות הביולוגית שלהן בהקשר של הגנה מפני קרינת UV והערכת הפוטנציאל שלהן כרגישות לאור עבור יישומי טיפול פוטודינמי. הממצאים האחרונים בקבוצת המחקר שלנו הדגימו את התכונות המופעלות באור של צבעי פלביליום מבוססי אמינו, וביססו אותם כסוג חדש ומבטיח של רגישים לאור. תרכובות אלו מציגות פוטנציאל משמעותי למחקר נוסף, וסוללות את הדרך ליישומים חדשניים בתחום.
באמצעות מערכת המיקרו-פלייט ולוח האור עם 96 בארות, אנו יכולים להשיג סינון תפוקה גבוהה של רגישים לאור בסביבה מבוקרת, מה שמפשט את הזיהוי וההשוואה בין מועמדים שונים לטיפול פוטודינמי. כדי להתחיל, הציגו את חיידקי הסטפילוקוקוס אוראוס על צלחת אגר מולר-הינטון מתרבית העצירה. דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לקבלת תרבות טרייה.
אוספים שתיים עד שלוש מושבות טריות מצלחת האגר ומדללים אותן בשישה מיליליטר של PBS סטרילי מסונן מחומם מראש ב-pH 7.4. מערבולת החיסון ב-1,200 סיבובים לדקה למשך שלושה עד ארבעה מחזורים כדי להומוגניזציה של הדגימה ולמשוך שלושה מיליליטר מהחיסון ההומוגני לקובטה חד פעמית. לאחר מדידת הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר, יש לדלל את הדגימה כך שתתאים לצפיפות האופטית של 0.1 באמצעות PBS.
הכן תמיסת מלאי של תרכובת הרגישות לאור בממס מתאים כגון DMSO או PBS. לדלל את תמיסת המלאי ב-PBS כדי ליצור את פתרון העבודה, ולהבטיח שרכיבי אמצעי תרבית החיידקים לא יפריעו לספיגת האור. מערבולת את פתרון העבודה כדי להבטיח הומוגניזציה מלאה.
כדי להתחיל, הכינו את תרחיף הסטפילוקוקוס הזהוב ואת תמיסת העבודה של תרכובת הרגישות לאור. הכן שתי צלחות נפרדות של 96 בארות, אחת מיועדת לחשיפה לאור ואחרת לשליטה בחושך. בכל צלחת, חלקו 100 מיקרוליטר כל אחד מתמיסת הרגישות לאור והתרחיף החיידקי.
מערבבים את התמיסות 5 עד 10 פעמים עם הפיפטה. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לאפשר לרגישות לאור לקיים אינטראקציה עם תאי החיידקים. לאחר הדגירה, הוציאו את הצלחות מהחממה.
שמור על אחת הלוחות מוגנת מפני חשיפה לאור כבקרת החושך. הנח את הצלחת השנייה של 96 בארות מעל לוח ה-LED המלבני של 50 וואט. סמן את קצוות הצלחת על משטח ה-LED כדי להבטיח מיקום עקבי על פני חזרות פרוטוקול.
חשוף את הצלחת לאור LED למשך כ-15 דקות. השתמש בצלחת נוספת של 96 בארות כדי להכין דילולים סדרתיים של הדגימות, כולל בקרות, בארות לא מוקרנות ומוקרנות. הוסף 180 מיקרוליטר PBS לכל באר, בהתאם למספר הדגימות.
יש לשים 20 מיקרוליטר מכל באר בלוחות המוקרנים והלא מוקרנים לעמודה הראשונה של הצלחת המלאה ב- PBS. בעזרת מיקרו פיפטה רב-ערוצית, בצע דילול סדרתי פשוט מבאר 1 עד 6. מחלקים צלחת אגר לשישה חלקים שווים כאשר כל חלק מתאים לאחד הדילול.
יש לשים 10 מיקרוליטר מכל באר על החלק המתאים של צלחת האגר. דגרו את הצלחת למשך 18 עד 20 שעות. הסר את צלחת האגר מהחממה וזהה אזורים המתאימים לספירת מושבות.
בתוך כל חלק של לוח המקדחה, ספרו את מספר היחידות היוצרות מושבה. ספקטרום טווח האור הנראה הראה שלוש פסגות נפרדות בין 400 ל-700 ננומטר. בתנאי חושך, אף אחת מתרכובות הפלביליום שנבדקו לא הראתה השפעות ציטוטוקסיות.
לעומת זאת, לאחר חשיפה לאור, התרכובות שנבדקו גרמו לירידה תלוית מינון בכדאיות של סטפילוקוקוס זהוב עם השפעות משמעותיות שנצפו בריכוזים של 6 ו-12 מיקרומולרים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה חסכונית להערכת היעילות של פוטו-סנסטיזטורים (photosensitizers) באינאקטיבציה פוטודינמית אנטיבקטריאלית (aPDI) באמצעות פלטת 96 בארי (96-well plate) ופאנל LED. טכניקה זו מאפשרת הערכה סימולטנית של תנאים ניסיוניים שונים, כולל ריכוזים שונים, תרכובות שונות וזני חיידקים שונים.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביוכימיה
- תרפיה פוטודינמית
רקע
- המחקר מתמקד בתרכובות פלאבליום להגנה פוטוכימית מפני קרינת UV.
- בדיקת הפעילות הביולוגית שלהן כפוטו-סנסיטייזרים.
- ממצאים אחרונים מדגישים את הפוטנציאל של צבעי פלאבליום מבוססי אמינו.
- סריקה בספיקו גבוהה מפשטת את הערכת המועמדים.
מטרת המחקר
- להערכת היעילות של פוטו-סנסיטיזטורים (photosensitizers) שונים.
- לזיהוי תרכובים מבטיחים עבור טיפול פוטודינמי.
- להעמקת ההבנה של השבתה פוטודינמית אנטי-בקטריאלית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש במיקרופלטה בעלת 96 בארות לצורך הבדיקה.
- יישום מקור אור של פאנל LED.
- החדרה של Staphylococcus aureus על אגר Mueller-Hinton.
- דגירה בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 שעות.
תוצאות עיקריות
- זיהוי פוטו-סנסטיזטורים (photosensitizers) יעילים.
- הדגמה של תכונות המופעלות על ידי אור של צבעי פלאבליום (flavylium).
- תוצאות סריקה בסביבה של תפוקה גבוהה המאפשרות השוואה יעילה של מועמדים.
- פוטנציאל ליישומים חדשניים בטיפול פוטודינמי.
מסקנות
- הוכשרה שיטה פשוטה להערכת תרגישים פוטו-כימיים (photosensitizers).
- תרכובות פלאביליום (Flavylium) מראות פוטנציאל למחקרים נוספים.
- גישה זו עשויה להוביל להתקדמות בטיפולים אנטי-בקטריאליים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרגים בכירים
סריקה in vitro בעלת תפוקה גבוהה המבוססת על LED מאפשרת הערכה מהירה של מולקולות הניתנות להפעלה פוטוכימית עבור אינאקטיבציה פוטודינמית אנטי-בקטריאלית, ובכך נותנת מענה לצרכים דחופים בתחום העמידות לאנטיביוטיקה. פלטפורמה זו תומכת במיון בשלב מוקדם של מועמדים לתפקיד פוטו-סנסיטיזטורים על ידי אספקת נתוני חיוניות סטנדרטיים, הניתנים לשחזור וכמותיים. שילוב של סריקה כזו בצינורות גילוי מאיץ את הזיהוי של תרכובים מבטיחים לצורך פיתוח תרגומי נוסף.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה שיטתית של יעילותו של הפוטוסנסיטייזר כנגד יעדים חיידקיים.
- תומך בהסרת סיכונים ביולוגיים על ידי הבחנה בין ציטוטוקסיות תלוית-אור לרעילות בחושך.
- מסייע בביסוס ביטחון חיזוי בבחירת מועמדים באמצעות נתונים כמותיים של הפחתת חיוניות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספקת הערכה סטנדרטית בקיבולת גבוהה של מספר תרכובות וריכוזים במקביל.
- מבטיחה הדירות ויכולת השוואה בין הרצות ניסיוניות באמצעות תאורת LED מבוקרת ופורמט של לוחית מיקרו (microplate).
- מייצרת פלטים כמותיים (יחידות יוצרות מושבות) לצורך דירוג איתן של תרכובות ואופטימיזציה של הבדיקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתבגר עם יעדים תרגומיים על ידי זיהוי מועמדים בעלי פעילות אנטיבקטריאלית חזקה המופעלת על ידי אור.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לאפיון תגובה למינון וסלקטיביות.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון עבור שיטות טיפול חדשניות למלחמה בזיהומים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטת סריקה זו המבוססת על LED מתאימה לממשק שבין השלב המוקדם של הגילוי לבין זיהוי מובילים (lead identification) עבור סוכני פוטודינמיקה אנטיבקטריאליים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ציטוטוקסיות המופעלת על ידי אור ובבדיקת סיכונים מכניסטית של מולקולות מועמדות.
- סריקה: מספקת מוכנות של הבדיקה והשחזוריות לצורך הערכה רחבה של תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה כמותית של חיוניות חיידקית והשפעות תלויות מינון.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין הגילוי להערכה פרה-קלינית על ידי זיהוי מועמדות בעלות פוטנציאל תרגומי.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה גמישה וניתנת לשימוש חוזר, הניתנת להתאמה למגוון מחלקות של פוטו-סנסטיזטורים ולזני חיידקים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בשלבים מוקדמים של גילוי חומרים אנטי-אינפקטיביים.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של זרימות עבודה ומאפשר קמפיינים של סריקה הניתנים לשחזור ובנייה מחדש בקנה מידה רחב.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) ואת יעילות ההון באמצעות ריכוז משאבים במועמדים שעברו תיקוף.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של מודליות חדשניות לאנטי-בקטריאליים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרוביולוגיה, פוטוכימיה ותכנון בדיקות כמותיות.
- נדרשת גישה לפאנלים של LED מכויילים, קוראי מיקרופלייטים ותשתיות לטיפול סטרילי.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של חשיפה לאור, טיפול בפלטות ופרוטוקולים לניתוח נתונים.
- ניתן להתאימה לזנים חיידקיים שונים ולכימוטיפים של פוטו-סנסיטיזטורים באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- מגבלות פוטנציאליות כוללות מסיסות של תרכובות, חדירות אור והפרעות מרכיבי המצע.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:57
Preparation of Culture and Compounds for Evaluating Photodynamic Activity of Photosensitizers Against Antibiotic-Resistant Bacteria
2:18
In Vitro Photodynamic Inactivation Assay for Bacteria: High-Throughput Testing of Photosensitizers Using LED Illumination
4:37
Representative Results
