הקרנה במבחנה מבוססת LED להערכת מולקולות הניתנות להפעלה פוטודינמית בהפעלה פוטודינמית של חיידקים
24 בינואר 2025
פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה וחסכונית להערכת היעילות של רגישים לאור פוטו-רגישים פוטנציאליים באינאקטיבציה פוטודינמית אנטיבקטריאלית (aPDI), תוך שימוש בפורמט צלחת של 96 בארות בשילוב עם מקור אור פאנל LED. גישה זו מאפשרת בדיקה בו-זמנית של תנאי ניסוי מרובים, כולל ריכוזים שונים, תרכובות וזני חיידקים.
המחקר שלי מתמקד בחקר מולקולות שונות ממשפחת תרכובות הפלביליום, הן טבעיות והן סינתטיות, עם עניין מרכזי בחקר הפעילות הביולוגית שלהן בהקשר של הגנה מפני קרינת UV והערכת הפוטנציאל שלהן כרגישות לאור עבור יישומי טיפול פוטודינמי. הממצאים האחרונים בקבוצת המחקר שלנו הדגימו את התכונות המופעלות באור של צבעי פלביליום מבוססי אמינו, וביססו אותם כסוג חדש ומבטיח של רגישים לאור. תרכובות אלו מציגות פוטנציאל משמעותי למחקר נוסף, וסוללות את הדרך ליישומים חדשניים בתחום.
באמצעות מערכת המיקרו-פלייט ולוח האור עם 96 בארות, אנו יכולים להשיג סינון תפוקה גבוהה של רגישים לאור בסביבה מבוקרת, מה שמפשט את הזיהוי וההשוואה בין מועמדים שונים לטיפול פוטודינמי. כדי להתחיל, הציגו את חיידקי הסטפילוקוקוס אוראוס על צלחת אגר מולר-הינטון מתרבית העצירה. דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לקבלת תרבות טרייה.
אוספים שתיים עד שלוש מושבות טריות מצלחת האגר ומדללים אותן בשישה מיליליטר של PBS סטרילי מסונן מחומם מראש ב-pH 7.4. מערבולת החיסון ב-1,200 סיבובים לדקה למשך שלושה עד ארבעה מחזורים כדי להומוגניזציה של הדגימה ולמשוך שלושה מיליליטר מהחיסון ההומוגני לקובטה חד פעמית. לאחר מדידת הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר, יש לדלל את הדגימה כך שתתאים לצפיפות האופטית של 0.1 באמצעות PBS.
הכן תמיסת מלאי של תרכובת הרגישות לאור בממס מתאים כגון DMSO או PBS. לדלל את תמיסת המלאי ב-PBS כדי ליצור את פתרון העבודה, ולהבטיח שרכיבי אמצעי תרבית החיידקים לא יפריעו לספיגת האור. מערבולת את פתרון העבודה כדי להבטיח הומוגניזציה מלאה.
כדי להתחיל, הכינו את תרחיף הסטפילוקוקוס הזהוב ואת תמיסת העבודה של תרכובת הרגישות לאור. הכן שתי צלחות נפרדות של 96 בארות, אחת מיועדת לחשיפה לאור ואחרת לשליטה בחושך. בכל צלחת, חלקו 100 מיקרוליטר כל אחד מתמיסת הרגישות לאור והתרחיף החיידקי.
מערבבים את התמיסות 5 עד 10 פעמים עם הפיפטה. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לאפשר לרגישות לאור לקיים אינטראקציה עם תאי החיידקים. לאחר הדגירה, הוציאו את הצלחות מהחממה.
שמור על אחת הלוחות מוגנת מפני חשיפה לאור כבקרת החושך. הנח את הצלחת השנייה של 96 בארות מעל לוח ה-LED המלבני של 50 וואט. סמן את קצוות הצלחת על משטח ה-LED כדי להבטיח מיקום עקבי על פני חזרות פרוטוקול.
חשוף את הצלחת לאור LED למשך כ-15 דקות. השתמש בצלחת נוספת של 96 בארות כדי להכין דילולים סדרתיים של הדגימות, כולל בקרות, בארות לא מוקרנות ומוקרנות. הוסף 180 מיקרוליטר PBS לכל באר, בהתאם למספר הדגימות.
יש לשים 20 מיקרוליטר מכל באר בלוחות המוקרנים והלא מוקרנים לעמודה הראשונה של הצלחת המלאה ב- PBS. בעזרת מיקרו פיפטה רב-ערוצית, בצע דילול סדרתי פשוט מבאר 1 עד 6. מחלקים צלחת אגר לשישה חלקים שווים כאשר כל חלק מתאים לאחד הדילול.
יש לשים 10 מיקרוליטר מכל באר על החלק המתאים של צלחת האגר. דגרו את הצלחת למשך 18 עד 20 שעות. הסר את צלחת האגר מהחממה וזהה אזורים המתאימים לספירת מושבות.
בתוך כל חלק של לוח המקדחה, ספרו את מספר היחידות היוצרות מושבה. ספקטרום טווח האור הנראה הראה שלוש פסגות נפרדות בין 400 ל-700 ננומטר. בתנאי חושך, אף אחת מתרכובות הפלביליום שנבדקו לא הראתה השפעות ציטוטוקסיות.
לעומת זאת, לאחר חשיפה לאור, התרכובות שנבדקו גרמו לירידה תלוית מינון בכדאיות של סטפילוקוקוס זהוב עם השפעות משמעותיות שנצפו בריכוזים של 6 ו-12 מיקרומולרים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתווה שיטה חסכונית להערכת היעילות של פוטו-סנסיטיזרים (photosensitizers) באינאקטיבציה פוטודינמית אנטיבקטריאלית (aPDI) באמצעות פלטת 96 בארות ופאנל LED. טכניקה זו מאפשרת הערכה סימולטנית של תנאים ניסיוניים שונים, כולל ריכוזים שונים, תרכובות שונות וזנים בקטריאליים שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביוכימיה
- טיפול פוטודינמי
רקע
- המחקר מתמקד בתרכובות פלביליום להגנה פוטו-כימית מפני קרינת UV.
- בחינת הפעילות הביולוגית שלהן כפוטו-סנסיטיזטורים (Photosensitizers).
- ממצאים אחרונים מדגישים את הפוטנציאל של צבעי פלביליום מבוססי אמינו.
- סריקה בתופעת רב-תהליכית (High throughput screening) מפשטת את הערכת המועמדים.
מטרת המחקר
- להערכת היעילות של פוטו-סנסיטיזטורים (photosensitizers) שונים.
- לזיהוי תרכובות מבטיחות עבור טיפול פוטודינמי.
- לשיפור ההבנה של אינאקטיבציה פוטודינמית אנטי-בקטריאלית.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- שימוש במיקרופלטה בעלת 96 בארות לצורך הבדיקה.
- יישום מקור אור של פאנל LED.
- הזרקה של Staphylococcus aureus על מצע Mueller-Hinton agar.
- דגירה בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 שעות.
תוצאות עיקריות
- זיהוי של פוטו-סנסיטיזטורים יעילים.
- הדגמה של תכונות המופעלות באור של צבעי פלאבליום.
- תוצאות של סריקה בתפוקה גבוהה המאפשרות השוואה יעילה בין מועמדים.
- פוטנציאל ליישומים חדשניים בטיפול פוטודינמי.
מסקנות
- בוססה שיטה פשוטה להערכת פוטוסנסיטיזטורים (photosensitizers).
- תרכובות פלוויליום (Flavylium) מראות פוטנציאל למחקר נוסף.
- גישה זו עשויה להוביל להתקדמויות בטיפולים אנטיבקטריאליים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
סריקה in vitro בתפוקה גבוהה מבוססת LED מאפשרת הערכה מהירה של מולקולות הניתנות להפעלה פוטוכימית לצורך השבתה פוטודינמית אנטי-בקטריאלית, ובכך נותנת מענה לצרכים דחופים בתחום העמידות לאנטיביוטיקה. פלטפורמה זו תומכת במיון ראשוני של מועמדים לתפקיד פוטו-סנסיטיזטורים על ידי אספקת נתוני חיוניות סטנדרטיים, הניתנים לשחזור וכמותיים. שילוב של סריקה כזו בתהליכי גילוי מאיץ את הזיהוי של תרכובות מבטיחות לפיתוח טרנסלציונלי נוסף.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה שיטתית של יעילות התמריצים הפוטו-סנסטיביזטורים (photosensitizers) נגד מטרות חיידקיות.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבחנה בין ציטוטוקסיות תלוית-אור לבין רעילות בחושך.
- מאפשר ביטחון חיזוי בבחירת מועמדים באמצעות נתונים כמותיים של הפחתת חיוניות.
סקר ופיתוח בדיקה
- מספק הערכה סטנדרטית בתפוקה גבוהה של תרכובות וריכוזים מרובים במקביל.
- מבטיח הדירות ויכולת השוואה בין הרצות ניסוייות באמצעות תאורת LED מבוקרת ופורמט של פלטה רב-בארים (microplate).
- מייצר פלטיים כמותיים (יחידות יוצרות מושבות) לצורך דירוג תרכובות איתן ואופטימיזציה של הבדיקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם יעדים טרנסלציונליים באמצעות זיהוי מועמדים בעלי פעילות אנטיבקטריאלית חזקה המופעלת על ידי אור.
- מספק המשכיות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לאפיון תגובה למינון וסלקטיביות.
- תומך בהחלטות קידום מבוססות ניהול סיכונים עבור מודליות חדשניות למניעה וטיפול בזיהומים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטת סריקה זו המבוססת על LED מתאימה לממשק שבין שלב הגילוי המוקדם לזיהוי מובילים (lead identification) עבור סוכני פוטודינמיקה אנטי-בקטריאליים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי ציטוטוקסיות המופעלת על ידי אור ובהפחתת סיכונים מכניסטיים של מולקולות מועמדות.
- סריקה: מספקת מוכנות של בדיקה ויכולת שחזור להערכה ניתנת להרחבה של תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה כמותית של חיוניות חיידקים והשפעות תלויות-מינון.
- מחקר תרגומי: מגשר בין שלב הגילוי להערכה פרה-קלינית על ידי זיהוי מועמדים בעלי פוטנציאל תרגומי.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה גמישה וניתנת לשימוש חוזר, הניתנת להתאמה למגוון מחלקות של פוטוסנסיטיזטורים ולזנים שונים של חיידקים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בשלבי הגילוי המוקדמים של תרופות אנטי-אינפקטיביות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של תהליכי העבודה ומאפשר קמפיינים של סריקה הניתנים לשחזור ובנייד.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי מיקוד המשאבים במועמדים מאושרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של מודליות אנטי-בקטריאליות חדשניות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרוביולוגיה, פוטוכימיה ותכנון בדיקות כמותיות.
- נדרשת גישה לפנלי LED מכויילים, לקוראי מיקרו-פלייטים ולתשתית לטיפול סטרילי.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי חשיפה לאור, טיפול בפלייטים וניתוח נתונים.
- ניתן להתאימו למגוון זנים חיידקיים וכימוטיפים של פוטו-סנסיטיזטורים באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- מגבלות פוטנציאליות כוללות מסיסות של תרכובות, חדירות אור והפרעות מרכיבי המצע.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:57
Preparation of Culture and Compounds for Evaluating Photodynamic Activity of Photosensitizers Against Antibiotic-Resistant Bacteria
2:18
In Vitro Photodynamic Inactivation Assay for Bacteria: High-Throughput Testing of Photosensitizers Using LED Illumination
4:37
Representative Results
