איתור נוגדנים עצמיים נגד MDA5 באמצעות תאי HeLa ואימונוציטוכימיה במיקרוסקופ אור

המטרה העיקרית של הניסוי הבא היא להשתמש באימונוציטוכימיה כדי לסנן נוגדנים נגד MDA5. זה נעשה באמצעות שימוש בתאי HeLa ולאחר מכן העברה של תא HeLa עם מבנה MDA5. ככזה, תאי הלה ייצרו חלבוני MDA5 שניתן לחבר על ידי נוגדנים MDA5.

לאחר הכללת תא HeLa עם מבנה MDA5, מגיב הטריטון משמש לחדירה לממברנה של תאי HeLa, מה שיאפשר לנוגדנים נגד MDA5 לעבור דרכו. לאחר מכן מתווסף נסיוב המטופל המכיל את הנוגדנים נגד MDA5. הנוגדנים נגד MDA5 יתחברו לחלבוני MDA5 בתוך תאי HeLa.

לאחר מכן, נוגדנים משניים, אליהם מחובר פרוקסידאז חזרת, נפרסים לתוך התאים, הנוגדנים המשניים יתחברו לנוגדנים נגד MDA5. לבסוף, הכרומוגן מתווסף לתאים ומתחמצן בנוכחות נוגדנים משניים מצומדים לחזרת פרוקסידאז, ומייצר צבע גלוי במיקרוסקופ אופטי. תוצאה חיובית בעמידה תראה משהו כמו בתמונה למעלה.

בהדגמת הווידיאו של היום, אנו זורמים לתחום קריטי של המחקר הרפואי, איתור נוגדן גן חמש הקשור להתמיינות נגד מלנומה, הנקרא גם נוגדן נגד MDA5. נוגדנים עצמיים אלה ממלאים תפקיד קריטי של אינדיקטור אבחון פשוט לחולים עם מחלת ריאות אינטרסטיציאלית, במיוחד אלה עם התקדמות מהירה חשיבות מחקר זה טמונה בהשפעתו הפוטנציאלית על תוצאות המטופלים. גילוי מוקדם ומדויק של נוגדנים עצמיים MDA5 חיוני לניהול יעיל של מחלה אוטואימונית קשה זו.

היתרון העיקרי של השיטה שהדגמנו על פני שיטת הזהב לסריקת נוגדנים עצמיים נגד MDA5 הוא שניתן לעשות זאת מהר יותר ולחסוך זמן ומאמץ בהשוואה לבדיקת הביקור החיסוני המסורתית עם תווית רדיו. יעילות מוגברת זו מאפשרת לנו לעבד יותר דגימות ולהפיק תוצאות במהירות. יתר על כן, חשוב לציין שהשיטה שלנו לא רק מציעה יעילות מעולה, אלא גם את עצמה בבטיחות ובעלות-תועלת בהשוואה לבדיקת משקעים חיסוניים מעבריים.

עכשיו, בואו נראה איך זה נעשה. עוזר המחקר שלי, טאו קאי פא יוביל את ההליך. שמרו על תאי HeLa עם מדיום הנשר המותאם של Dulbecco המכיל סרום בקר עוברי 10%, ואנטי-פטריית אנטיביוטית 1% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה של 5% CO2.

העבירו את התאים כל יומיים-שלושה, או כאשר התאים מגיעים ל-90 עד 100% מפגש. שב 70,000 תאי HeLa על כל באר מצלחת 24 בארות. 24 שעות לפני הטרנספקציה, ונטו את התאים, אשר כ -90% מפגש.

לדלל 500 ננוגרם של פלסמין ו-1.5 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה כל אחד ב-25 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת. הוסף DNA מדולל, בצע ריאגנט טרנספקציה מדולל ביחס של אחד לאחד. מערבבים היטב ודוגרים במשך חמש דקות.

הוסף תערובת לתאים שיושבים יום לפני וערבב כדי לערבב את קומפלקס השומנים של ה- DNA מיד. ודא שהתאים הם 80 עד 90% מתלכדים. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחצי כדור לח של 5% CO2, 40 עד ארבע שעות, והמשיכו לאימונוציטוכימיה.

אנו משתמשים בגורם זמין מסחרית. מידע נוסף ניתן למצוא בטבלת החומרים. יעילות הטרנספקציה שלהם היא 50% ניתן לקבוע את הצלחת הטרנספקציה והביטוי של חלבון המטרה על ידי העברת התאים עם חלבון קפוא המבטא פלסמיד והובלת דם מערבי כדי לדמיין את ביטוי חלבון המטרה לאחר הדגירה, שטפו את התאים פעמיים עם PBS כדי להסיר את כל המדיה שנותרה.

ניתן לבצע כביסה על ידי ניעור הצלחת או שייקר מסלולי. תקן את התאים עם 4%paraformaldehyde בזהירות PBS. פרפורמלדהיד רעיל.

השתמש בהנחיות טיפול מתאימות. השאירו את התאים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השלך את המגיב המקבע.

השתמש ב-PBS כדי לשטוף את התא פעמיים. מרחו מגיב טריטון ואז הניחו לתאים לשבת 10 דקות בטמפרטורת החדר. השתמשנו בטריטון X 400 ב-PBS בריכוז של 0.3%לאחר 10 דקות, השלך את המגיב טריטון.

הוסף PBS כדי לשטוף את התאים פעם אחת. השלב הבא, בצע חסימה עם סרום בקר עוברי 10% ב-PBS והשאיר את התאים למשך שעה בטמפרטורת החדר, הסר את המגיב החוסם. לאחר מכן, הוסף PBS כדי לשטוף את התאים פעם אחת.

הוסף את פלזמת המטופל המדוללת לתאים. הקפד לדלל את פלזמת המטופל ביחס של 1 עד 5,000 דילול ב-PBS לפני השימוש. כוונן את הדילול כדי לשפר את האות או להקטין את הרקע לפי הצורך כדי להבטיח תוצאות ללא משוא פנים.

הצוות ערך את הבדיקה, לא ידע אילו דגימות שייכות לחולים ואילו היו מאנשים בריאים. דגירה של דגימה בארבע מעלות צלזיוס למשך 12 עד 16 שעות. לאחר תקופת הדגירה, הסר את דגימת המטופל ושטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS.

טפל בתאים עם עז מצומדת חזרת מדוללת, IgG אנטי אנושי ביחס של דילול אחד עד 250 ב-PBS. השאירו את התאים למשך שעה בטמפרטורת החדר. שעה לאחר מכן, השלך את הנוגדן המשני.

יש לשטוף עם PBS שלוש פעמים. לאחר שטיפת התאים, יש לצבוע את התאים בתמיסת עבודה של 300 מיקרוליטר DAB לכל באר. פתרון העבודה של DAB מוכן על ידי תרכיז קידום DAB חסר, ומדלל DAB בהתאם להוראות היצרן.

לאחר צביעת התא למשך חמש דקות, הסר את הצבע. לאחר הסרת הצבע יש לשטוף במים המזוקקים המיוננים ולנער במשך חמש דקות. מכתים את גרעין התא בהמטוקסין מדולל.

אנו משתמשים בהמוטוקסין ב כדי לאהוב, בקיפול 10 דילול. המתן חמש דקות לתהליך הצביעה. לאחר חמש דקות, השלך את ההמוטוקסין, ולאחר מכן שטוף עם המים המזוקקים המנותחים פעמיים למשך חמש דקות כל אחד.

שלב אחרון, התבונן בתוצאות הצביעה במיקרוסקופ אופטי. בואו נפרש את תוצאות הבדיקה האימונוציטוכימית שלנו עבור נוגדנים עצמיים נגד MDA5. תוצאה חיובית.

חיובי אמיתי מראה כתמים חומים חזקים בתוך HeLa המבטאים MDA5. זה מאשר נוגדנים עצמיים נגד MDA5 בדגימת המטופל. תוצאה שלילית.

תוצאה שלילית מראה תאי HeLa ללא צביעה חומה, מה שמעיד על היעדר נוגדנים עצמיים נגד MDA5. תוצאה חיובית כוזבת. באופן קריטי, תוצאה חיובית כוזבת מראה צביעה חומה נרחבת בכל התאים, ללא קשר לביטוי MDA5s.

יש להבחין בין צביעה לא ספציפית זו הנראית על מנת שמצבים אוטואימוניים לבין חיובי אמיתי כדי למנוע אבחון שגוי. השיטה שלנו מציעה דרך מהירה, בטוחה וחסכונית יותר לאיתור נוגדנים לאיברים נגד MDA5. יש לכך פוטנציאל להשפיע באופן משמעותי על תוצאות המטופלים בניהול מחלת ריאות אינטרסטיציאלית.

לאחר צפייה בסרטון זה, תלמדו כיצד לבצע את הליך האימונוציטוכימיה וכיצד לזהות רלוונטיות קלינית בתוצאות הבדיקה.