טיהור, הרחבה ופנוטיפ מבוסס ציטומטריה של תאי גזע מזנכימליים במח עצם שמקורם בעכבר

המחקר שלנו מספק שיטה בעלות נמוכה לטיהור והרחבה של תאי גזע מזנכימליים הומוגניים של מח עצם עכבר. זה עוזר לחוקרים להשיג מספיק תאים באיכות גבוהה עם יכולות גדילה והתמיינות חזקות. אתגר מרכזי במחקר תאי גזע של מח עצם הוא פיתוח פרוטוקול פשוט ויעיל לבידוד תאי גזע מזנכימליים של מח עצם. שיטה זו מאפשרת לתאי גזע מזנכימליים של מח העצם לגדול לרוחב על ידי הימנעות מהפרעות. הוא משתמש במעבר שלישי, נמנע מהשפעות גדילה נוספות ושומר על תאים המטופויאטיים בסביבה כדי לתמוך בבריאות ובתפקוד של תאי הגזע.

[מדריך] כדי להתחיל, יש להשרות את העכבר המורדם ב 75%, אתנול למשך חמש דקות. בעזרת מספריים לדיסקציה סטרילית, בצע חתך של כסנטימטר אחד בגפה האחורית, ליד גיד אכילס. לאחר מכן, בצע חתך מעגלי סביב הגפה האחורית כדי לחשוף את השוקה הדיסטלית. קלף את העור ממקום החתך כלפי מעלה לכיוון הירך כדי להסיר את העור משתי הגפיים האחוריות. חותכים לאורך עצם הכסל כדי לנתק את ראש הירך מעצם הירך. בעזרת אזמל סטרילי, הסר כמה שיותר גידים ושרירים מהשוקה והפיבולה כדי להקל על השטיפה מאוחר יותר. החזירו את העצמות הנקיות לכלי המכיל PBS עם 2% פניצילין וסטרפטומיצין לפני העברתם למכסה מנוע סטרילי. קח מזרק של 50 מיליליטר והצמד את המחט שמגיעה עם המזרק. מלאו את המזרק ב-20 מיליליטר של מדיום אלפא MEM, והחליפו את המחט בזו שמגיעה עם מזרק מיליליטר אחד. במכסה המנוע הסטרילי, השתמש במספריים כדי לחתוך את שני קצוות עצם הירך או השוקה המופרדים. כעת, הכנס את המחט לעצם בקצה החתוך ושטוף את מח העצם לתוך צלחת תרבית תאים בגודל 100 מילימטר המכילה מדיום אלפא MEM שלם. המשיכו לשטוף עד שהעצם הופכת חיוורת באופן ניכר, מה שמעיד על שאיבת מח עצם מוצלחת. פיפטה למעלה ולמטה 40 פעמים באמצעות קצה פיפטה של מיליליטר אחד כדי לפזר כל אגרגט תאים. כעת, סננו את תרחיף התאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר כדי להסיר פסולת, שברי רקמות וגושים לא מפוזרים. כוונן את הנפח הכולל ל-15 מיליליטר עם מדיום אלפא MEM שלם, והעביר את תרחיף התאים המסונן לתבנית תרבית של 100 מילימטר. החזיקו את המנה בשתי ידיים וסובבו אותה בעדינות 15 פעמים בתנועה של דמות שמונה כדי לפזר את התאים באופן שווה על פני המנה. לבסוף, הניחו את צלחת התרבות בחממה ותרבית של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני למשך חמישה ימים. איור זה ממחיש את ההתקדמות המורפולוגית של תאי סטרומה של מח העצם מהמיצוי הראשוני ועד למעבר השלישי בתרבית. תאי מח עצם טריים שחולצו נראו בעיקר חד-גרעיניים עם טיפות שומן מפוזרות שנראו בכל השדה. ביום החמישי של התרבית, תאים בצורת ציר החלו להופיע והגיעו לכ-60% עד 80% מפגש, והמשיכו לעלות בצפיפות עד היום השביעי. מהמעבר הראשון למעבר השלישי, תאי סטרומה של מח העצם שמרו על מורפולוגיה של ציר או פיוזיפורם, יצרו שכבה חד-שכבתית ברורה עם מושבות מחוברות זו לזו, ולא הראו סימנים של אפופטוזיס כגון גרעיניות ציטופלזמית או פיצול גרעיני. ציטומטריית זרימה אישרה כי CD29, CD44 ו-Sca-1 באו לידי ביטוי גבוה בתאי סטרומה של מח העצם. הביטוי של סמני CD31 ו-CD45 של שושלות אנדותל והמטופויאטיות היה זניח. כימות הסמן אישר עוד רמות ביטוי גבוהות של CD29, CD44 ו-Sca-1 בהשוואה ל-CD31 ו-CD45.