Name: הדמיה וכימות מורפולוגיה מיטוכונדריאלית ב - C. elegans במהלך ההזדקנות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: למדו הדמיה וכימות מורפולוגיה מיטוכונדריאלית ב-C. elegans במהלך הזדקנות. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לנתח שינויים במבנה התאי בזחלים מודל ולהבין את הקשר בין מורפולוגיה לתפקוד מיטוכונדריאלי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>ניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלית ב - C. elegans

<table><tbody><tr><td>5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUDR)</td> <td>ספקטרום כימי</td><td>F2026-10GMBL</td><td>לעיכוב התפשטות</td></tr><tr><td>APEX IPTG</td><td>Genesee</td><td>18-242</td><td>עבור RNAi</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>VWR</td><td>90000-764</td><td>עבור לוחות NGM</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>VWR</td><td>97064-330</td><td>עבור לוחות NGM</td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידרט</td><td>VWR</td><td>97061-904</td><td>לצלחות NGM</td></tr><tr><td>קרבניצילין</td><td>VWR</td><td>76345-522</td><td>עבור כולסטרול RNAi</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>80057-932</td><td>עבור צלחות NGM</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי&nbsp;</td><td>Stellaris 5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>BDH1115-1LP</td><td>ממס לתרופות</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ HistoBond</td><td>VWR</td><td>16005-110</td><td>להכנת שקופיות</td></tr><tr><td>מרק LB</td><td>VWR</td><td>95020-778</td><td>עבור LB</td></tr><tr><td>LEICA S7E היקף ניתוח</td><td>Leica</td><td>10450840</td><td>מיקרוסקופ ניתוח סטנדרטי</td></tr><tr><td>LEICA STELLARIS 5</td><td>Leica</td><td></td><td>158101100 מיקרוסקופ קונפוקלי</td></tr><tr><td>LEICA THUNDER</td><td>Leica</td><td></td><td>11525679 תרכובת מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי heptahydrate</td><td>VWR</td><td>97062-132</td><td>עבור לוחות NGM, M9</td></tr><tr><td>pL4440 וקטור ריק פלסמיד</td><td>addgene</td><td>פלסמיד #1654</td><td>עבור פלסמיד וקטורי ריק</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>VWR</td><td>97061-566</td><td>עבור אקונומיקה סולוטון</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט dibasic</td><td>VWR</td><td>EM-PX1570-2</td><td>עבור צלחות NGM</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>VWR</td><td>EM-PX1565-5</td><td>עבור M9</td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>VWR</td><td>97064-646</td><td>עבור תולעים משתקות</td></tr><tr><td>נתרן כלוריד</td><td></td><td>VWR EM-SX0420-5</td><td>עבור לוחות NGM, M9</td></tr><tr><td>נתרן היפוכלוריט</td><td>VWR</td><td>RC7495.7-32</td><td>עבור תמיסת</td></tr> <tr><td>אקונומיקהנתרן פוספט דו-בסיסי</td><td>VWR</td><td>71003-472</td><td>עבור M9</td></tr><tr><td>טטרציקלין הידרוכלוריד</td><td>VWR</td><td>97061-638</td><td>עבור RNAi</td></tr><tr><td>WOB-L&not; &AElig; משאבות ואקום יבשות, חובה סטנדרטית, Welch&not; &AElig;</td><td>VWR</td><td>80077-612</td><td>לשאיפה</td></tr></tbody></table>

הדמיה וכימות מורפולוגיה מיטוכונדריאלית ב - c. elegans במהלך ההזדקנות

Imaging and Quantifying Mitochondrial Morphology in C. elegans During Aging

C. elegans הוא מודל נהדר להדמיה מיטוכונדריאלית בשל גופו השקוף, המאפשר הדמיה קלה של תולעים שלמות, חיות ללא הכנת דגימה מוגזמת. בנוסף, ניתן לדמיין בקלות מורפולוגיה מיטוכונדריאלית ברקמות שונות על ידי שימוש במקדמים ספציפיים לרקמות כדי לבטא חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדי מיטוכונדריה. כאן, myo-3p (למיטוכונדריה בשרירים), vha-6p (למיטוכונדריה במעי) ו-col-19p (למיטוכונדריה היפודרמלית) שימשו להנעת ביטוי של GFP ממוקד מיטוכונדריה (רצף לוקליזציה מיטוכונדריאלי של חלבון ATP-1). המיטוכונדריה של שרירי דופן הגוף של C. elegans מציגים מורפולוגיה צינורית, ומתיישרים לאורך סיבי שריר (מיופיברילים) (איור 1A); מיטוכונדריה במעי הראתה מבנים דמויי רשת מחוברים מאוד, עם יישור פחות אחיד (איור 1B); ולהיפודרמיס יש מיטוכונדריה צינורית שנראית מעוגלת יותר או בצורת אליפסה בהשוואה למעי או לשריר (איור 1C). המורפולוגיה המיטוכונדריאלית עקבית בדרך כלל לאורך התולעת בשריר ובמעי, אך ההיפודרמיס מציג כמה הבדלים קלים בקישוריות ההדדית של המיטוכונדריה בין הקצה הפרוקסימלי והדיסטלי של התולעת. לפיכך, כדי להשיג תוצאות ניסיוניות הניתנות לשחזור, מומלץ להתמקד באזור ספציפי בגופם. כאן, האזור שבין הלוע לפות ~100-200 מיקרומטר מתחת ללוע מצולם באופן עקבי.
עבור מיטוכונדריה של שרירים והיפודרמיס, הדמיה שלהם תחת מיקרוסקופ מורכב מספקת רזולוציה מספקת בשל שטוחות התאים ורמות נמוכות של אור לא ממוקד. עם זאת, קשה לצפות במיטוכונדריה של המעי באמצעות מיקרוסקופ מורכב, מאחר שהנפח הגדול של המעי מגביל את הרזולוציה עקב כמות גדולה של אור לא ממוקד מחלקים אחרים של המעי (איור 2). לכן, מומלץ לצלם מיטוכונדריה במעי תחת מיקרוסקופ קונפוקלי כדי להפחית אור לא ממוקד ולדמיין מורפולוגיה מיטוכונדריאלית תקינה.
צורת המיטוכונדריה דינמית מאוד ומשתנה בהתאם לסביבה המטבולית של בעלי החיים23 או אפילו עקב חשיפה לנוקשות מצע משתנה24. לכן, השארת בעלי חיים על מגלשות מיקרוסקופ לפרקי זמן ממושכים בהיעדר מקור מזון ועל מצע הזכוכית הנוקשה עלולה להשפיע על המורפולוגיה המיטוכונדריאלית. כאן, מחקר זה מצא כי המיטוכונדריה של תולעים מתפרקת לאחר כ-30 דקות על שקופית בתמיסת M9, כאשר המיטוכונדריה ההיפודרמלית מציגה את הפיצול הרב ביותר (איור 3). לכן, יש לבצע הדמיה של המיטוכונדריה במהירות לאחר הכנת הדגימה.
כימיקלים המגבילים את ניידות התולעים, כולל נתרן אזיד וטטרמיסול, משמשים בדרך כלל להדמיה חיה של C. elegans, שכן תולעים נייחות נדרשות ללכוד חתכי z מרובים של בעלי חיים לצורך הדמיה תלת מימדית. מחקרים קודמים הראו כי חשיפה לנתרן אזיד או טטרמיסול עלולה לגרום לפיצול מיטוכונדריאלי25. באופן מפתיע, נמצא כי לנתרן אזיד - אפילו בריכוזים גבוהים - הייתה השפעה מוגבלת על המורפולוגיה המיטוכונדריאלית בשריר או במעי. עם זאת, ההיפודרמיס הציג פיצול מיטוכונדריאלי מוקדם יותר מאשר בקרות M9 (איור 3). חשוב לציין, ריכוזים גבוהים של טטרמיסול (100 מ"מ) הביאו לפיצול מיטוכונדריאלי משמעותי מיד לאחר החשיפה בכל סוגי התאים. לשם השוואה, ריכוזים בינוניים (10 מ"מ) הביאו לפיצול מהיר יותר בהשוואה לביקורת M9. לריכוזים נמוכים (1 מ"מ) הייתה השפעה מוגבלת על המורפולוגיה המיטוכונדריאלית. נתונים אלה מצביעים על כך ששימוש בנתרן אזיד יכול להיות אופציה מעשית להדמיה מהירה של המיטוכונדריה, בעוד שבדרך כלל יש להימנע מטטרמיזול.
כצפוי, המיטוכונדריה של כל הרקמות של C. elegans מציגה פיצול במהלך תהליך ההזדקנות הטבעי (איור 4A). ניתן לדמיין את הפיצול כמיטוכונדריה המוצגים כמבנים קטומים וכדוריים יותר, השונים באופן דרמטי מהמיטוכונדריה הליניארית והצינורית המוצגת בבעלי חיים צעירים. חשוב לציין כי המעי אכן גדל במבנים אוטו-פלואורסצנטיים כדוריים בגיל מאוחר יותר, ולכן יש להקפיד לא לבלבל בין אוטו-פלואורסצנטי למבנים מיטוכונדריאלים בפועל. מכיוון שיכולה להיות שונות של שינויים במבנה המיטוכונדריאלי בין תולעים, חשוב לבצע כימות של מורפולוגיה מיטוכונדריאלית על גודל מדגם משמעותי ולא רק הדמיה של כמה תולעים. כאן נעשה שימוש ב-mitoMAPR, המאפשר כימות אוטומטי של מורפולוגיה מיטוכונדריאלית באמצעות קבוצה מגוונת של מדדים, כולל אובייקטים, רשתות, צמתים לכל רשת, נקודות צומת, אורך אובייקט, טביעת רגל מיטוכונדריאלית, כיסוי מיטוכונדריאלי ושטח אובייקט (טבלה משלימה 1 וטבלה משלימה 2). האוטומציה מסירה הטיה סובייקטיבית מהמשתמש. כאן, אנו מדווחים כי מדד אורך האובייקט הוא אופטימלי למדידה כמותית של השינויים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית של השרירים והמעיים במהלך ההזדקנות, ומדדי נקודות צומת למדידת השינויים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית ההיפודרמלית במהלך ההזדקנות (איור 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig01.jpg"> 
איור 1: תמונות של מיטוכונדריה בכל הגוף של C. elegans. הדמיה מיטוכונדריאלית בוצעה לאורך כל היום 5 בעלי חיים בוגרים שגדלו על EV משלב L1 בבעלי חיים טרנסגניים עם ביטוי MLS::GFP בשריר (A), במעי (B) ובהיפודרמיס (C). סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig02.jpg"> 
איור 2: השוואה של הדמיה מיטוכונדריאלית בין מיקרוסקופ מורכב למיקרוסקופ קונפוקלי. הדמיה מיטוכונדריאלית בוצעה בבעלי חיים בוגרים ביום 1 שגדלו על EV משלב L1 בבעלי חיים טרנסגניים עם ביטוי MLS::GFP בשריר (A), במעי (B) ובהיפודרמיס (C). סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig03.jpg"> 
איור 3: הערכת פיצול מיטוכונדריאלי של רקמות שונות לאחר טיפול ב-M9, נתרן אזיד וטטרמיסול. הדמיה מיטוכונדריאלית בוצעה בבעלי חיים בוגרים ביום הראשון עם ביטוי של MLS::GFP בשרירים, במעי ובהיפודרמיס. בעלי חיים גודלו על EV משלב L1. בעלי חיים הונחו על מגלשות המכילות M9, נתרן אזיד (1 מ"מ, 10 מ"מ ו-100 מ"מ), או טטרמיסול (1 מ"מ, 10 מ"מ ו-100 מ"מ) וההדמיה בוצעה מיד לאחר הכנת השקופית (0 דקות) או 15 דקות או 30 דקות לאחר הכנת השקופית. תמונות מייצגות מוצגות עבור n &gt; 5 בעלי חיים לזן עבור 2 שכפולים ביולוגיים. פסי קנה מידה: 5 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig04.jpg"> 
איור 4: הדמיה מיטוכונדריאלית של C. elegans במהלך הזדקנות ברקמות שונות וכימות מורפולוגיה מיטוכונדריאלית באמצעות MitoMAPR. (A) הדמיה מיטוכונדריאלית בוצעה בחיות בוגרות בימים 1, 5, 9, 13 ו-15 של הבגרות עם ביטוי של MLS::GFP בשריר, במעי ובהיפודרמיס. בעלי חיים גודלו על EV משלב L1 והועברו ללוחות EV המכילים FUDR משלב היום הראשון למבוגרים. התמונות מייצגות n ≥ 5 בעלי חיים לזן עבור ≥ 3 שכפולים ביולוגיים. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. (B) כימות אורך האובייקט של מיטוכונדריית השריר ומיטוכונדריית המעיים של תולעים בימים 1, 5, 9, 13 ו-15, וכימות נקודות הצומת של מיטוכונדריה תת-עורית של תולעים בימים 1, 5, 9, 13 ו-15. כל נקודות הנתונים הבודדות בשילוב עם ממוצע ± SD. גרפים שורטטו ונותחו סטטיסטית באמצעות מבחן t של תלמיד. ns = לא מובהק, *p &lt; 0.03; **עמ' &lt; 0.002; עמ' &lt; 0.0002; עמ' &lt; 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ימים של תולעים</td>
			<td>מספר תולעים</td>
			<td>נפח המאגר (מ"ל)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>25</td>
			<td>13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>25</td>
			<td>14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>20</td>
			<td>15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13</td>
			<td>20</td>
			<td>15</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1: מספר מומלץ של תולעים ונפחי חיץ בעת הכנת שקופיות.
איור משלים 1: זרימות עבודה של יישום כימות תמונה בודדת באמצעות MitoMAPR ועיבוד אצווה עבור תמונות מרובות. (A) זרימת עבודה של כימות המורפולוגיה המיטוכונדריאלית מתמונה בודדת באמצעות מאקרו MitoMAPR. (ב) הקרנת Z של קובץ תמונה תלת-ממדית גולמית באמצעות פיג'י (הקרנה מקסימלית). (C) חיתוך אזור העניין מהתמונה המוקרנת Z. (D) תמונות שלד שהתקבלו ממאקרו MitoMAPR. פסי קנה מידה: 5 מיקרומטר. (ה) זרימת עבודה של כימות המורפולוגיה המיטוכונדריאלית מתמונות מרובות באמצעות תהליך אצווה באמצעות מאקרו MitoMAPR. (F) צילום מסך של מאקרו חיתוך. (G) צילום מסך של תהליך אצווה עבור הקרנת Z. (H) צילום מסך של חלון אישור הבחירה של מאקרו חיתוך אצווה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
טבלה משלימה 1: ניתוח כמותי של מדדי מורפולוגיה מיטוכונדריאלית ברקמת השריר C. elegans . המדדים שנרשמו כוללים אובייקטים, רשתות, צמתים לכל רשת, נקודות צומת, אורך אובייקט, טביעת רגל מיטוכונדריאלית, שטח אובייקט וכיסוי מיטוכונדריאלי, הנמדדים על פני ימים שונים. הנתונים מספקים בסיס להערכת שינויים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית עם ההזדקנות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610_Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
טבלה משלימה 2: השפעות של כימיקלים משתקים על המורפולוגיה המיטוכונדריאלית ב - C. elegans. הנתונים כוללים מדידות כגון אובייקטים, רשתות, צמתים לכל רשת, נקודות צומת, אורך אובייקט, טביעת רגל מיטוכונדריאלית, שטח אובייקט וכיסוי מיטוכונדריאלי על פני ריכוזים ונקודות זמן משתנים לאחר הכנת הדגימה עם מאגר M9 או ריכוזים שונים של טטרמיזול ונתרן אזיד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610_Supplementary%20Table%202.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>

הדמיה וכימות מורפולוגיה מיטוכונדריאלית ב - C. elegans במהלך ההזדקנות

Mitochondria, important cellular organelles found in most eukaryotic cells, are major sites of energy production through aerobic respiration. Beyond this ...

imaging-quantifying-mitochondrial-morphology-c-elegans-during

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שריר שלד הוא חיוני לתנועה, והוא חנות החלבון העיקרית של הגופים. מדידות בריאות שרירים בתוך סי אלגנס מתוארות. שינויים פוטנציאליים למבנה שרירים ובתפקודם הוערכו באמצעות ה- GFP מקומי וצבעים קטיוני.

שיטות להערכת subcellular תאים של שריר ב C. elegans

מחקר זה מתאר את המידות הכמותיות של גודל ולוקליזציה, מורפולוגיה שרירים וצורה מיטוכונדרילית ב -C. אלגיה באמצעות כלים זמינים לעיבוד תמונות באופן חופשי. גישה זו מאפשרת לימודים עתידיים ב -C. אלגיה להשוות בין היקף רקמות ושינויים מבניים כתוצאה מוטציות גנטיות.

גישות כמותיים ללימוד מבנים סלולאריים ומורפולוגיה ארגונית בקנבאבדיוטיס

חקר מיטופגיה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, חיישנים גנטיים ואימונופלואורסנציה דורש ציוד יקר, כוח אדם מיומן והשקעת זמן משמעותית. כאן, אנו מדגימים את היעילות של ערכת צבע פלואורסצנטית מסחרית בכימות תהליך המיטופגיה הן ב- Caenorhabditis elegans והן בקו תאים לסרטן הכבד.

איתור מיטופגיה בתאי Caenorhabditis elegans ובתאי יונקים באמצעות צבעים ספציפיים לאברונים

הזרקות מקומיות של תווית צבע מיטוכונדריאלי סופית של מיטוכונדריה תא שוואן ב-vivo למיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו משתמשת בהוכחת היתכנות שהודגמה ברקמת שריר שלד של עכברים עם שריר בריא או חולה, כדי לספק הדמיה מיטוכונדרית ברזולוציה גבוהה.

שיטות לכימות במקום של מורפולוגיית מיטוכונדריה בתאי שריר וסופיים של עכברים

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

אנו מתארים שיטה רגיש לזהות הרגולטורים postembryonic של ביטוי חלבונים לוקליזציה...

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

שיטת הערכת כמותית תגובת chemotactic...

Assay Chemotaxis סי אלגנס

כאן מוצג כיצד לעקוב ולכמת תהליכי התפתחות ב-C. elegans. השיטות המוצגות מבוססות על כלי קוד פתוח הניתנים ליישום בקלות. הוא מודגם כיצד לשחזר מודלים תלת מימדיים בצורת תא, כיצד לעקוב באופן ידני אחר מבנים תת-תאיים וכיצד לנתח זרימת התכווצות קליפת המוח.

מעקב וכימות תהליכים התפתחותיים ב<em&gt; C. elegans</em&gt; שימוש בכלי קוד פתוח

מטרת השיטה המובאת כאן היא לבחון חלבון צבירת במהלך הזדקנות נורמלית בתוך האורגניזם דגם C. elegans. הפרוטוקול מייצג כלי רב עוצמה כדי ללמוד מצרפי גדול מאוד מסיסים היוצרים עם הגיל וכדי לקבוע כיצד משפיעים השינויים פרוטוסטאזיס חלבון צבירת.

שיטות מחקר לשינויים הגלום צבירת חלבון עם הגיל ב Caenorhabditis elegans

למדו הדמיה וכימות מורפולוגיה מיטוכונדריאלית ב-C. elegans במהלך הזדקנות. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לנתח שינויים במבנה התאי בזחלים מודל ולהבין את הקשר בין מורפולוגיה לתפקוד מיטוכונדריאלי.

הדמיה וכימות מורפולוגיה מיטוכונדריאלית ב - C. elegans במהלך ההזדקנות

גלה סרטונים נוספים