תיוג פלואורסצנטי להמחשת חלבונים בעלי ביטוי נמוך בדג הזברה

מוצר זה מותאם ליישור חלבונים עם תג החלבון הקרינה, וכדי לדמיין את המיקום והביטוי של החלבון של אדם מעבדה מעניין של דג הזברה. זה שימושי במיוחד להדמיית חלבונים המתבטאים בשפע נמוך. השיטה שלנו מפשטת ומאיצה את תהליך בניית התורם.

רכיבים אלה, למעט ה-CDS, משולבים בעמוד השדרה מראש. התורם עבר אופטימיזציה גם כדי להגביר את היעילות. זרימת העבודה של מסך השידור צוברת גרעין הניתן להורשה בעלות הנמוכה ביותר של זמן ומאמץ.

דג הזברה הוא אורגניזם המודל הנמצא בשימוש נרחב במחקר על זיהום וחסינות. אנו מתעניינים במיוחד במנגנונים העומדים בבסיס אלח דם. מכיוון שכעת אנו מסוגלים לבצע תיוג פלואורסצנטי בקלות באמצעות הפרוטוקול שלנו, ננסה לתייג תמונה, חלבוני אלח דם ותאים בדג הזברה.

כדי להתחיל, הנח דג זברה נקבה בריא אחד ושני דגי זברה זכרים בריאים לתוך מיכל הזדווגות. השתמש במפריד כדי להפריד בין הזכרים לנקבות כדי להכין אותם להזדווגות. ביום המיקרו-הזרקה, הכינו את תערובת המיקרו-הזרקה על קרח בסביבה נטולת RNase.

בעזרת קצה פיפטה נטול Rnase, טען את תמיסת הזרקת המיקרו לתוך המחט. הנח את המחט הטעונה לתוך מניפולטור מיקרו המחובר למזרק מיקרו. תחת מיקרוסקופ, השתמש בפינצטה מחודדת כדי לחתוך את קצה המחט על ידי צביטה בעדינות עד שהיא נשברת.

כוונן את לחץ ההזרקה עד שהמחט פולטת באופן עקבי טיפה של ננו-ליטר אחד. לאחר מכן, הסר את המחיצה ממיכל ההזדווגות, ואפשר לדגים להתרבות במשך שש דקות. אסוף והעביר את העוברים בשלב התא האחד לצלחת פטרי המכילה מאגר עוברים.

בדוק את בריאות העוברים במיקרוסקופ אור והסר ביציות או פסולת לא מופרות. הניחו בצד 20 עוברים בריאים בצלחת פטרי נפרדת כבקרות ללא הזרקה, ותייגו את המנה. בעזרת מברשת קטנה, העבירו וסדרו בעדינות עוברים בריאים בשלב תא אחד על החריצים של צלחת מיקרו-הזרקה המחוממת לטמפרטורת החדר.

הסר עודף חיץ מהצלחת. בעזרת קצה מחט, התאם בעדינות את המיקום של כל עובר כך שמוט החיה יפנה למחט. הזריק ננוליטר אחד של התמיסה המעורבת לקוטב החי.

לאחר ההזרקה יש לשטוף בעדינות את העוברים לצלחת של 6 בארות עם מאגר עוברים. הנח את הצלחת בחממה בטמפרטורה קבועה של 28.5 מעלות צלזיוס. 10 שעות לאחר ההפריה יש לבחון את ההתפתחות העוברית במיקרוסקופ סטריאו ולהוציא עוברים מתים.

24 שעות לאחר ההפריה, אספו עוברים לצינורות של 1.5 מיליליטר לצורך גנוטיפ, והשליכו מים מיותרים בזהירות. הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר ליזה המכיל פרוטאינאז K לכל צינור. דגרו את הצינורות בחום של 56 מעלות צלזיוס למשך שעה, ולאחר מכן בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

לאחר הדגירה מוסיפים 200 מיקרוליטר אתנול ומערבבים היטב. צנטריפוגה של הצינור ב-19,000 גרם למשך 10 דקות והשליכו את הסופרנטנט לפני השעיית הגלולה עם 500 מיקרוליטר של אתנול 70%. צנטריפוגה שוב וייבשו את הכדור באוויר לפני המסתו ב-50 מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים.

השתמש במיקרוליטר אחד של התמצית כדי להכין את תערובת התגובה ל-PCR. לאחר PCR, הפעל ג'ל אגרוז עם שני מיקרוליטר של מוצרי PCR כדי לאשר הגברה מוצלחת. בצע עיכול אנזימטי כדי להעריך את היעילות של ה-sgRNAs.

מערבבים בעדינות את תמיסת העיכול ומודגרים בטמפרטורת החדר, בהתאם להוראות היצרן. הפעל ג'ל אגרוז למוצרים מעוכלים לצד בקרות PCR לא מעוכלות כדי לאשר את העיכול. כדי לנתח את יעילות sgRNA, פתח את אתר TIDE ולחץ על התחל TIDE.

הזן את רצף ההנחיה של ה-sgRNA לתוך מסגרת רצף המדריך. לחץ על עיון כדי להעלות את תוצאת הרצף של פקד הסוג הפראי לשדה הכרומטוגרמה של דגימת הפקד. באופן דומה, העלה את תוצאת הרצף של הדגימה הערוכה לשדה הכרומטוגרמה של דגימת הבדיקה.

לחץ על Update View כדי לנתח את התוצאות. כדי להתחיל, השתמש בשיבוט עצמאי של קשירה או LIC עם אקסונוקלאז III כדי לבנות את הפלסמיד התורם. תכנן פריימר F1 עם רצף חופף עם האלמנט הווקטורי 1 וחלק מהאלמנט 2.

תכנן פריימר R2 עם חלק מרכיב 1, אלמנט 2 ואלמנט 3. תכנן פריימר F2 כך שיכלול אלמנטים 3 ו-4, ואת רצף 5 הראשוניים של ה-CDS העוקב אחר אתר המטרה sgRNA. תכנן פריימר R1 עם רצף שלושת הראשוניים של רצף הציפוי ורצף חופף עם הווקטור.

השתמש ב-CDNA של דג הזברה כתבנית ובצע PCR עם הפריימרים המעוצבים. טהר את מוצרי ה-PCR באמצעות משקעי אתנול. לעכל את וקטור התורם עם אנזימי הגבלה כגון pCI ו-Acc65I, ולטהר את וקטור התורם המעוכל.

כמת את שברי ה-PCR המטוהרים ואת וקטור התורם המעוכל באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל DNA. לאחר מכן, הכינו את תערובת ה-LIC עם וקטור תורם מטוהר ודגרו על קרח למשך 60 דקות. הוסף מיקרוליטר אחד של 0.5 EDTA מולארי כדי לעצור את התגובה.

פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב את התמיסה. דגרו את תערובת התגובה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. מצננים את מוצרי LIC על קרח.

לאחר מכן, הפוך תאים מוכשרים DH5-Alpha באמצעות מוצרי LIC. צלחו את התאים שעברו טרנספורמציה על צלחות לוריא-ברטאני המכילות את האמפיצילין, וגידלו אותם במשך 16 שעות. לאחר הדגירה, בחר מושבות בודדות מלוחות ה-LIC לניתוח עיכול אנזימטי וריצוף DNA.

חלץ וטהר פלסמידים נכונים של תורם עם ערכת טיהור. הזרקו לעוברי דג הזברה תערובת מיקרו-הזרקה לדפיקת גנים 12 עד 48 שעות לאחר הזרקת מיקרו, תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו, התבוננו בפלואורסצנטיות של זחלי דג הזברה. באמצעות שיטת סינון מבוססת, בחר את הזחלים הפלואורסצנטיים וגדל אותם בנפרד.

בגיל חודש, אספו חתיכה קטנה מסנפיר הקיפוד מכל דג זברה מורדם לתוך צינור PCR מסומן. הנח את דג הזברה המורדם המתאים בצלחת של 6 בארות מלאה במים מסוננים מעוקרים UV התואמים את התווית על הצינור. חלץ DNA גנומי בשיטת הליזה האלקליין.

תכנן פריימר קדמי במעלה הזרם של זרוע ההומולוגיה השמאלית ופריימר הפוך על התוספת. בצע PCR, תוך התמקדות בצומת חמשת הראשוניים של הרצף. בחן את עוברי F1 המתקבלים על ידי הזדווגות של דג הזברה F המוקרן עם דג זברה מסוג בר לדפוסי ביטוי GFP.

גנוטיפ של עוברי F1 באמצעות PCR צומת. פלואורסצנטיות ספציפית תורשתית נצפתה בשרירים של כל צאצאי F1, מה שמצביע על תיוג GFP מוצלח של קונקסון 39.9. פלואורסצנטיות ספציפית תורשתית זוהתה בעדשה של כל צאצאי F2, מה שמרמז על תיוג מוצלח של mCherry של connexon 44.1.

דפיקות נכונות של קונקסונים 39.9 ו-44.1 אומתו באמצעות תגובות שרשרת פולימראז צומתיות.