הדמיית מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי בהילוך מהיר של Pseudomonas aeruginosa ו - Staphylococcus aureus פנוטיפים הטרוגניים

מחקר המעבדה שלנו מתמקד בסיבות לכישלון אנטיביוטי. בפרט, אנו מתעניינים בתאים המעטים שנקראים עקשנים באוכלוסיות החיידקים שאמורים להיהרג על ידי האנטיביוטיקה, אבל הם יכולים לשרוד טיפול אנטיביוטי. וחושבים שהעקשנים האלה גורמים להישנות הזיהומים לאחר סיום הטיפול האנטיביוטי.

לכן אנו מעוניינים לבחון את ביטוי הגנים ואת חילוף החומרים של המתמידים האלה כדי להבין טוב יותר את אסטרטגיות ההישרדות שלהם. האתגר הנוכחי עבור השדה המתמיד הוא לאזן את התפוקה עם רגישות התא הבודד. עלינו להתאים את יכולתו של תא בודד להתחלק לאחר הטיפול, שתגדיר אותו כמתמיד, עם פנוטיפ מדיד כלשהו שיכול לעזור לנו להבין את פעולתו הפנימית של התא.

וייתכן שנצטרך לעשות זאת עבור אלפי תאים כדי ללכוד אפילו מתמיד אחד. הפרוטוקול שלנו פותח כדי להיות מיושם בקלות בהשוואה לשיטות כריך אגר לא מדויקות או ייצור של מכשירים מיקרופלואידים, אשר יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית. מצאנו שהפרוטוקול שלנו מניב הדמיה יציבה וניתנת לשחזור לאורך זמן עם מינימום חומרים, כלומר הוא גם חסכוני וגם בזבזני באופן מינימלי לאיסוף נתונים איכותי.

המחקר העתידי שלנו ישתמש בשילוב של אומיקה וגישות של תאים בודדים כדי לחקור כיצד פתוגנים מגיבים לטיפול בסוגים שונים של אנטיביוטיקה ומתאוששים מהם. המטרה הסופית שלנו היא למנף הבנה זו כדי לפתח אסטרטגיות חדשניות לשיפור הטיפול בזיהומים קליניים. כדי להתחיל, הניחו החלקת כיסוי סטרילית בקוטר 30 מ"מ לתחתית בסיס הנירוסטה של צלחת כיסוי הניתנת להחלפה.

השחילו בעדינות את כניסת הפוליקרבונט לבסיס, וודאו שחלקת הכיסוי יוצרת את בסיס התא ואטמו אותו במקומו על ידי דחיסת טבעת ה-O מסיליקון המצורפת. הניחו חוצץ מותאם אישית המודפס בתלת-ממד כנגד מכסה ה-30 מ"מ כדי למנוע תאים מודאליים מזיהום צולב. מכינים 1.5% אגרוז בצינור חרוטי של 50 מיליליטר באמצעות המדיה הרצויה ומערבלים בעדינות לערבוב.

שחררו את מכסה הצינור החרוטי והכניסו אותו לכוס זכוכית או למחזיק כספת למיקרוגל. חממו את תערובת האגרוז במיקרוגל גבוה, ועצרו כל שלוש עד ארבע שניות כדי לערבל ולערבב כדי למנוע בעבוע. לאחר דקה, בדקו אם נשאר אגרוז לא מומס בתערובת.

אם הוא צלול באופן אחיד, מניחים לאגרוז להתקרר לזמן קצר עד לסביבות 60 מעלות צלזיוס. מוסיפים את האנטיביוטיקה או המתים הרלוונטיים ומערבלים בעדינות כדי לערבב, תוך הימנעות מהיווצרות בועות. פיפטה שני מיליליטר של האגרוז לתוך התא עם כיסוי 30 מ"מ להחליק.

הניחו בעדינות כיסוי סטרילי בקוטר 25 מ"מ מעל האגרוז בפתח החדר העליון. הניחו לפד להתמצק למשך שעה עד שעתיים. כאשר הפד מוצק, השתמש בטוש קבוע קצה דק כדי לסמן את המיקומים והזהויות של כל דגימה על פתק כיסוי 25 מ"מ.

הפוך את התא כך שטבעת בסיס הנירוסטה פונה כלפי מעלה והחזק בזהירות את תוספת הפוליקרבונט שמתחתיה תוך ביטול השחלת הבסיס. הניחו את בסיס הנירוסטה בצד. החליקו את מכסה ה-30 מ"מ, החליקו את כרית האגרוז והשליכו אותה.

לדלל את תרביות התאים Pseudomonas aeruginosa או Staphylococcus aureus ב- PBS לצפיפות דלילה המתאימה להדמיה של תאים בודדים. פיפטה במרץ למעלה ולמטה כדי להפיץ באופן שווה את התאים. הבחינו בחמישה מיקרוליטרים של מתלי התאים המדוללים במקומות המסומנים על כרית האגרוז.

לאחר ייבוש הכתמים, הניחו כיסוי סטרילי חדש בקוטר 30 מ"מ מעל הפד. לאחר מכן החזיקו את תוספת הפוליקרבונט ביד אחת והשחיל מחדש באיטיות את בסיס הנירוסטה מעל החלקת הכיסוי. לאחר האטימה של התא, בדקו אם האגרוז יוצר מגע עם פני השטח של החלקת הכיסוי בקוטר 30 מ"מ.

בעזרת הקצה הקהה של הפינצטה, לחץ בעדינות על מכסה ה-25 מ"מ עד שהאגרוז נוגע בכיסוי ה-30 מ"מ מחליק באופן שווה על פני השטח שלו. כדי להתחיל, להכין את המיקרוסקופ ואת תא ההדמיה בקרות סביבתיות על ידי הגדרת הבמה העליונה אינקובטור וטמפרטורת אינקובטור תא גדול ל 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הפעל את מכשיר האדים החדר.

הכניסו תכשיר כרית אגרוז אחד לאינקובטור העליון של הבמה וסגרו את התא כדי לאפשר איזון. הכן את תוכנת MetaMorph לרכישת תמונות על-ידי הגדרת אלגוריתם המיקוד האוטומטי המובנה לשימוש בערוץ הפאזה במהלך רכישה רב-ממדית. בכרטיסייה 'שלב', הגדירו מיקומי שלבים מרובים לכל דגימה, והתמקדו בשדות תצוגה בעלי צפיפות תאים המפוזרת באופן אחיד.

לאחר מכן, בכרטיסיה קיטועי זמן, הגדר את משך הזמן והתדירות עבור רכישת תמונה. בכרטיסייה אורכי גל, הגדר את הערוצים הרצויים לרכישה והתאם את זמני החשיפה בהתבסס על עוצמת האות של הדגימה. לאחר שכרית האגרוז התחממה בחדר, הניחו את מכסה הלחות על האינקובטור העליון של הבמה.

לאחר מכן, במיקרוסקופ, עבור ממצב ניגודיות פאזה למצב ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית. כוונן את המעבה ואת דיאפרגמת הצמצם כדי להשיג הארה נכונה של קוהלר. לאחר השלמת ההתאמות, חזור למצב ניגודיות פאזה.

נווט לכל מיקום במה, התאם את המיקוד ואפס את מיקום הבמה למישור המוקד החדש. לחץ על כפתור הרכישה כדי להתחיל את הרכישה הרב-ממדית. לאחר הרכישה, כדי לקמפל תמונות, פתחו את MetaMorph והשתמשו ביישום Review Multidimensional Data כדי לבחור את הערוצים או אורכי הגל הרצויים ולכלול את כל נקודות הזמן עבור כל מיקום בשלב.

לחצו על 'טען תמונות' ושמרו כל אוסף בשם הערוץ המתאים לו כקובץ TIFF. בוצעה הדמיה בהילוך מהיר של תאי סטפילוקוקוס זהוב שהראתה צביעת יודיד פרופידיום עם התקדמות הטיפול האנטיביוטי, מה שהצביע על נזק לקרום. הדמיית Pseudomonas aeruginosa במהלך הטיפול האנטיביוטי הראתה תאים שעוברים היווצרות ספרופלסט, נימה ועיבוי ציטופלזמי, בליווי צביעת יודיד פרופידיום.

הכנה מוצלחת של פד אגרוז ותנאי הדמיה אפשרו תצפית על סטפילוקוקוס זהוב המתאושש מטיפול אנטיביוטי ועל Pseudomonas aeruginosa המתאושש מטיפול אנטיביוטי ליצירת אשכולות גדולים שמקורם בתאים בודדים.