ניתוח פעילות תאי T אנושיים במסגרת תרבית משותפת אלוגנית של תאי גידול שטופלו מראש
7 במרץ 2025
הפרוטוקול הנוכחי מתאר זרימת עבודה ניסויית המאפשרת ניתוח ex vivo של גירוי תאי T אנושיים במערכת תרבית משותפת אלוגנית עם תאי גידול שטופלו מראש.
תאי גידול משנים את הפנוטיפ החיסוני במהלך הטיפול, מה שעשוי להשפיע על התוצאה ולכן מטרת המחקר שלנו היא לחקור את האינטראקציה בין תאי T לתאי גידול כדי ליצור הבנה טובה יותר של אינטראקציות אלה.
שיפור הרגישות לקרינה, במיוחד בגידולים עמידים לקרינה על ידי שילוב רדיותרפיה למעכבי קינאז. התמקדות בתגובה לנזק ל-DNA היא כיום חלק מרכזי בהתפתחויות האחרונות. מודלים תלת מימדיים של תרביות תאים ומודלים של תרבית משותפת מוקמים כיום בתחום הרדיוביולוגיה כדי להגדיל את יכולת ההשוואה בין נתוני מבחנה לנתונים in vivo.
[קריין] כדי להתחיל, השג תאי גידול HSC4 בנפח מתאים של מדיום D10. זרע לפחות שלוש בארות לכל מצב, כל אחת מכילה 15,000 תאים ב-200 מיקרוליטר של מדיום ב-96 צלחות באר. ייעד צלחת אחת לטיפול מדגמי, כולל בארות לתאי גידול בלבד ובקרה של תאי T בלבד ובארות לספירת תאים לכל טיפול ביום התרבית המשותפת. ביום השני יש לטפל בתאי הגידול במעכבי קינאז בריכוזים הנדרשים. הקרין צלחת אחת לאחר שלוש עד ארבע שעות ואותו הדבר לאחר 24 שעות דגירה עם חמישה אפורים להקרנה היפופרקציונית. עבור תאים חד-גרעיניים בדם היקפי, או בידוד PBMC, העבירו את הדם המעורב של EDTA שנאסף מתורם בריא לשני צינורות צנטריפוגה של 50 מיליליטר. מלאו את שני צינורות הצנטריפוגה עד 50 מיליליטר עם PBS ו-2% FBS. לאחר מכן, הכינו שישה צינורות צנטריפוגה עם שיבוצי פלסטיק להפרדת PBMC. מלאו כל אחד מהם ב -15 מיליליטר של מדיום שיפוע בצפיפות קרה. שכבו בזהירות את מדיית שיפוע הצפיפות עם 12 עד 15 מיליליטר של הדם המדולל. צנטריפוגה את הצינורות ב -1,200 גרם למשך 10 דקות ללא האטה. לאחר הצנטריפוגה, העבירו את הסופרנטנט לארבעה צינורות צנטריפוגה חדשים של 50 מיליליטר. השלך את הצינורות המשומשים. מלאו את צינורות הצנטריפוגה החדשים עד 50 מיליליטר ב-PBS ו-2% FBS וצנטריפוגה ב-120 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו בזהירות את הסופרנטנט. השעו מחדש את כדור התא במיליליטר אחד של PBS המכיל 2% FBS ושלבו את שני הכדורים לצינור בז אחד. מלאו שוב את צינור הצנטריפוגה ל -50 מיליליטר עם PBS המכיל 2% FBS. צנטריפוגה את ה- PBMCs ב -300 גרם למשך 10 דקות. השליכו בזהירות את הסופרנטנט. השעו מחדש את גלולת התא ב-80 מיקרוליטר של MACS בתוספת מאגר לכל 10 בחזקת שבעה תאים. הוסף 20 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזי CD8 לכל 10 לעוצמה של שבעה תאים וערבב בזהירות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. דוגרים במשך 15 דקות בחום של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, שטפו את התאים עם שני מיליליטר MACS בתוספת חיץ לכל 10 בחזקת שבעה תאים. צנטריפוגה את הצינור בחום של 300 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת הסופרנטנט, השעו מחדש את התאים ב-1000 מיקרוליטר של MACS בתוספת חוצץ. הצב שני עמודי MS במגנט והנח שני צינורות צנטריפוגה של 15 מיליליטר מתחת. איזון העמודות עם 500 מיקרוליטר של MACS בתוספת מאגר. לאחר מכן טען נפח שווה של מתלה התא לעמודת MS המוכנה. שוטפים את העמודות עם 500 מיקרוליטר MACS בתוספת מאגר שלוש פעמים. סמן את התאים הסופיים שנאספו כזרימה דרך או CD8 שלילי ושלב אותם בצינור צנטריפוגה יחיד אחד. לאחר מכן קח צינור צנטריפוגה חדש של 15 מיליליטר שכותרתו תאי T חיוביים CD8. שטוף את שתי העמודות המכילות תאי T חיוביים CD8 עם תווית מגנטית עם 1000 מיקרוליטר של MACS בתוספת מאגר כל אחד. לפני צביעת תאי ה- T, יש לצנטריפוגה אותם בחום של 300 גרם למשך חמש דקות. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא ב-1000 מיקרוליטר של PBS. צנטריפוגה את המתלה שוב ב -300 גרם למשך חמש דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, השעו מחדש את גלולת התא ב-2000 מיקרוליטר של תמיסת צביעה מיקרו-מולרית אחת של CFSE. דוגרים במשך 20 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים המוכתמים ב -300 גרם למשך חמש דקות. לאחר שטיפת התאים עם PBS, השעו אותם מחדש במדיום תאי T. זרע את התאים לתוך CD3 ו- CD28 מצופה שש צלחת באר ודגירה. ביום הרביעי, קצרו את תאי ה-T והשעו אותם מחדש במדיום שלהם. הוסף את המספר הרצוי של תאי T לבארות תאי הגידול ביחס של אחד לאחד לאחר ספירת הבארות המיועדות לכך. ביום השביעי, הסר את לוחית התרבית מהחממה לכימות התפשטות תאי T. לאחר שטיפת התאים, צבעו אותם בנוגדנים הרצויים ובצעו זרימה ציטומטרית כדי להעריך את תאי ה-T. אל תכלול את אוכלוסיית הכפילים על סמך אזור הפיזור קדימה לעומת גובה הפיזור קדימה כדי לקבל סינגלים. התווה את הסינגלטים כדי לזהות תאי T על סמך אזור הפיזור הקדמי לעומת אזור הפיזור הצדדי. התווה את ביטוי CD3 כנגד אזור הפיזור הצדדי כדי להבחין בין תאי T. יתר על כן, זהה תאי T חיוביים ל-CD8 לאחר התוויית אות CD8 כנגד אזור הפיזור הצדדי. כל תאי ה-T צריכים לבטא CD3 ו-CD8. התווה את אות ה-CFSE של כל תאי ה-T החיוביים ל-CD8 כהיסטוגרמה. לאחר השלמת שלבי השער, בחר תאי T חיוביים CD8 כקלט ונתח את ביטוי האיזוטיפ CD25 או HLA-DR שלהם על ידי התוויית הקרינה של סמן פני השטח המתאים כנגד אזור הפיזור הצדדי. שיעור תאי ה-T המתרבים גדל בתרבית משותפת עם תאי גידול HSC4 מוקרנים. טיפול בקרינה או RT ו-RT בתוספת עיכוב ATR שיפר משמעותית את התפשטות תאי T בהשוואה לעיכוב RT בתוספת ATM. מבין תאי ה-T המתרבים ביותר, עיכוב RT בתוספת ATR היה היעיל ביותר בגירוי התפשטות. הביטוי של CD25 בתאי T הופחת לאחר תרבית משותפת עם תאי גידול HSC4 שטופלו ב-RT. טיפול מקדים בתאי גידול עם מעכב ATM בלבד הפחית משמעותית את ביטוי CD25 בהשוואה למעכב ATR. השילוב של מעכב RT ו-ATM הביא לביטוי מוגבר של CD25 בהשוואה למעכב RT בתוספת ATR. ביטוי HLA-DR על תאי T היה בדרך כלל מווסת על ידי RT. תרבית משותפת עם תאי HSC4 שטופלו מראש עם מעכב RT בתוספת ATR הגדילה עוד יותר את ביטוי HLA-DR בהשוואה ל-RT בלבד או מעכב RT בתוספת ATM.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתווה תהליך עבודה לניתוח ex vivo של סטימולציה של תאי T אנושיים במערכת של קולטורה משותפת (co-culture) אלוגנית עם תאי גידול שעברו טיפול מוקדם. המחקר בוחן את האינטראקציה בין תאי T לתאי גידול כדי להעמיק את ההבנה של התגובות החיסוניות במהלך טיפול.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- אימונולוגיה
- אונקולוגיה
- רדיובלוגיה
רקע
- תאי גידול יכולים לשנות תגובות חיסוניות במהלך טיפול.
- הבנת האינטראקציות בין תאי T לתאי גידול היא חיונית לשיפור התוצאות הטיפוליות.
- שילוב של רדיותרפיה עם מעכבי קינאז עשוי להגביר את יעילות הטיפול.
- מודלים תלת-ממדיים ומודלים של תרבית משותפת (co-culture) חיוניים לחקר אינטראקציות אלו.
מטרת המחקר
- ניתוח השפעותיה של טיפול מקדים בתאי גידול על גרייה של תאי T.
- הערכת ההשפעה של רדיותרפיה ומעכבי קינאז על שגשוג תאי T.
- שיפור ההבנה של תגובות תאי T בהקשר של טיפול בגידולים.
שיטות שהשתמשו בהן
- בידוד תאים מונונוקלאריים של דם היקפי (PBMCs) מתורמים בריאים.
- תרבית משותפת (Co-culture) של תאי T עם תאי גידול שהוקרנו.
- ציטומטריית זרימה להערכת שגשוג תאי T וביטוי של סמני שטח.
- שימוש במעכבי קינאז ובטיפול בקרינה (radiotherapy) בטיפולים ניסיוניים.
תוצאות עיקריות
- תרבית משותפת עם תאי גידול שהוקרנו הגבירה את שגשוג תאי T.
- השילוב של RT ועיכוב ATR היה היעיל ביותר בגירוי שגשוג תאי T.
- ביטוי CD25 בתאי T הופחת לאחר תרבית משותפת עם תאי גידול שטופלו ב-RT.
- ביטוי HLA-DR בתאי T הוגבר באופן כללי על ידי רדיותרפיה.
מסקנות
- המחקר מספק תובנות לגבי תגובות של תאי T לתאי גידול תחת טיפול בהקרנה.
- טיפולים משולבים עשויים להגביר את האקטיבציה והשכפול של תאי T.
- דרוש מחקר נוסף כדי למטב אסטרטגיות טיפוליות המכוונות לתגובות של תאי T.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח כמותי של פעילות תאי T אנושיים בתרבית משותפת אלוגנית עם תאי גידול שעברו טיפול מקדים נותן מענה לצורך קריטי בהערכת תגובה חיסונית חזויה בתהליכי גילוי תרופות לאונקולוגיה. זרימה זו של עבודה מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של השפעות אימונו-מודולטוריות מטיפולים בקרינה ומעכבי קינאז, ובכך תומכת בתיקוף המטרה ובהמשכיות תרגומית. הגישה מסייעת בקבלת החלטות לגבי תיק תרופות על ידי הבהרת האינטראקציות בין מערכת החיסון לגידול תחת תנאי טיפול רלוונטיים מבחינה קלינית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות בנוגע לסילוק תאי גידול בתיווך תאי T.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי כימות השגחה והפעלה של תאי T בתגובה למודולציה של תאי הגידול.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים של סוכנים אימונומודולטוריים מועמדים בסביבת ex vivo מבוקרת.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מספק מערכת של תרבית משותפת (co-culture) שעברה תיקוף להערכה סטנדרטית של תגובות תאי T לתאי גידול שעברו טיפול מקדם.
- מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור באמצעות ניתוח פרוליפרציה מבוסס CFSE וניתוח סמני אקטיבציה באמצעות ציטומטריית זרימה.
- מאפשר התרחבות (scalability) של הבדיקה ושימוש חוזר בפלטפורמה לסריקת תרכובות המכוונות לאינטראקציות בין מערכת החיסון לגידול.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה נתונים של תגובה חיסונית ex vivo לתנאים של מיקרו-סביבת גידול הרלוונטיים למחלה.
- תומך בפיתוח ביומרקרים טרנסלציונליים על ידי קישור סממנים להפעלת תאי T לשיטות טיפול.
- מפחית את ההסתמכות על מודלים פרה-קליניים in vivo על ידי אספקת נתונים חסונים לגבי אינטראקציה בין מערכת החיסון האנושית לגידול.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
שיטה זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לבדיקה מונחית-השערה של אינטראקציות בין מערכת החיסון לגידול בעקבות התערבות טיפולית.
- ביולוגיה של הגילוי: מכמת את השגשוג וההפעלה של תאי T בתגובה לטיפולים ספציפיים בתאי גידול, ובכך תומך בבירור מסלולים ביולוגיים.
- סריקה: מספקת קריאות סטנדרטיות הניתנות לשחזור להערכה של תרכובות המודולות את מערכת החיסון.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות המבוססות על ציטומטריה של זרימה ו-ELISA לצורך השוואה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מסייעת בהתאמה של נתוני חיסון ex vivo לאסטרטגיות של סמנים ביולוגיים קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת תרבית משותפת (co-culture) רב-שימוש לצרכי מחקר מגוונים בתחום האימונו-אונקולוגיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בוויסות התגובה החיסונית ובתיקוף המטרה.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של בדיקות אינטראקציה בין מערכת החיסון לגידול לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) על ידי הבהרת ההשפעות המכניסטיות של טיפולים משולבים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מועמדים לאימונו-מודולציה המותאם לסיכון, בהתבסס על תוצאות חיסוניות פונקציונליות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בבידוד תאי מערכת חיסון ראשוניים של בני אדם ובניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה.
- נדרשת גישה לציוד הקרה, למעכבי קינאז ולפאנלים מאושרים של נוגדנים.
- נחוצה סטנדרטיזציה בין-צוותית של תנאי תרבית משותפת (co-culture) ושל פרוטוקולים אנליטיים.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור שורות תאי גידול שונות או מקורות שונים של תאי מערכת חיסון.
- התפוקה עלולה להיות מוגבלת בשל שונות בין תורמים וזמינות של תאים ראשוניים.
