באתרו בידוד ותרבות של חיידקי קרקע עקשנים באמצעות שבב בידוד (iChip)

מאגרים עשירים של מיקרובים קיימים בסביבות טבעיות מגוונות, כגון אדמה, גופי מים וסביבות קיצוניות. עם זאת, ניצול המגוון הביולוגי העצום הזה מוגבל במידה רבה על ידי שיטות מעבדה ומדיה. על ידי מעבר מחסום תרבותי זה וניצול המגוון הביולוגי הזה יש פוטנציאל לתת מענה לצרכים ביוטכנולוגיים שונים, כמו גם לפתור אתגרים גלובליים.

לדוגמה, התפתחות עמידות אנטי-מיקרוביאלית נקבעה לבריאות הציבור העולמית. חיידקי קרקע שקשה לגדל במעבדה עשויים לייצר תרכובות ביו-אקטיביות חדשות עם פעילות אנטי-מיקרוביאלית חזקה שיכולות להיות בעלות ערך בהתמודדות עם האתגר העולמי של מערכות אנטי-מיקרוביאליות. המגוון העצום של חיידקים סביבתיים ותוצריהם לא נחקרו מכיוון שטכנולוגיות מסורתיות מבוססות תרבית מעבדה מובילות לעתים קרובות לבידוד של חיידקים ידועים דומים. מטרת ניסוי זה היא להדגים תרבית תפוקה גבוהה של חיידקי קרקע עקשנים באתרם באמצעות טכנולוגיית IChip. בפרוטוקול זה, נדגים את הבנייה והשימוש בטכנולוגיית IChip זו שניתן להשתמש בה לגידול תפוקה גבוהה באתרם של חיידקים קשים לגידול והתאוששות של חיידקים המייצרים אנטי-מיקרוביאלים כיישום של טכנולוגיה זו.

[מגישה] כדי להתחיל, צור עיצוב ראשוני של הלוחות העליונים, התחתונים והאמצעיים של שבב הבידוד בתוכנת מצגת. השתמש באפשרות הוספת צורה בתוכנת המצגת כדי להוסיף עיגולים במידות הכרחיות שישמשו כ-IChip. הכנס עיגולים קטנים יותר פנימה כדי לייצג ערוצי IChip. מסדרים את העיגולים הקטנים יותר בתבנית הרצויה להכנת עיצוב ראשוני לצלחת העליונה, התחתונה והאמצעית של ה- IChip. בחר את העיצוב והשתמש בתפריט הלחיצה הימנית כדי לשמור את העיצוב הראשוני כתמונה. באמצעות העיצוב הראשוני כתבנית, התחל ליצור עיצוב דו מימדי באמצעות תוכנת עיצוב בעזרת מחשב. מתפריט הסקיצה, הכנס צורות מוגדרות מראש, בעיקר עיגולים ליצירת העיצוב הבסיסי ללוחות IChip ואזור הערוצים. השתמש באפשרות הממד לקביעת הממדים בפועל של הלוחות והתעלות. לחץ על אישור כדי לסיים את העיצוב ולאחר מכן השתמש בפונקציית השחול כדי להמיר את העיצוב הדו-ממדי למודל תלת מימד בעובי הרצוי. לבסוף, השתמש בתפריט file כדי לשמור עותק של דגם התלת-ממד בפורמט קובץ ליתוגרפיה סטילס התואם להדפסת תלת מימד.

[מגישה] אסוף את כל הפריטים החיוניים שיידרשו לאיסוף דגימות אדמה והגיע לאתר ממנו יש לאסוף את הדגימה. פותחים את אפליקציית הקידוד הגיאוגרפי לנייד ומוצאים את הכתובת הייחודית בת שלוש המילים של אתר הדגימה ומתעדים אותה. לאחר מכן, רשום מטא נתונים רלוונטיים לדוגמא, כגון הטמפרטורה, התאריך, השעה, עומק הדגימה, מזג האוויר וחשיפת האתר לפגעי מזג האוויר. יש לרסס את חפירה ואת קופסת הפוליסטירן בה יש לשתול את ה-IChip ב-70% אתנול. נגב אותם עם נייר טישו ואפשר לאתנול להתייבש לחלוטין באוויר. לאחר מכן השתמש באת המטוהרת כדי לפנות כל פסולת פני השטח, כגון פסולת עלים או סלעים כדי לחשוף את האדמה העליונה. לטהר את האת שוב כמו קודם. בעזרת האת, גשו לאדמה בעומק של שלוש עד שש בליעות מתחת לפני השטח, והעבירו כארבעה עד חמישה ק"ג אדמה מעומק אחיד לתוך קופסת הפוליסטירן. הקופסה צריכה להיות מלאה בכ-75%. העבר את האדמה שנאספה בחזרה למעבדה באופן מיידי. מדגימת האדמה שנאספה, שקלו גרם אחד של אדמה נקייה מפסולת, סלעים ופסולת עלים, לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מיל המכיל 10 מ"ל של מי מלח סטריליים. מערבבים את האדמה עם מי המלח תוך כדי מערבולת של כ-10 שניות ליצירת תמיסת אדמה. השאירו את צינור הצנטריפוגה ללא הפרעה למשך חמש דקות כדי לאפשר לחלקיקי האדמה הגדולים בצינור להתיישב. לאחר מכן העבירו בזהירות את תרחיף האדמה הסופרנטנטי למבחנה טרייה המסומנת כ-S. באמצעות תרחיף האדמה כדגימה הלא מדוללת, בצע אפס דילול על ידי העברת מ"ל אחד מהדגימה לתשעה מ"ל של מי מלח סטריליים בשפופרת טרייה. הכן דילול מ-10 הוא להספק מינוס אחד ל-10 הוא להספק מינוס חמש. בתוך ארון בטיחות ביולוגית, משטח מטהר את הצלחת העליונה, הצלחת התחתונה והצלחת האמצעית, של ה-IChip על ידי השריית 70% אתנול למשך 10 דקות. שטפו את עודפי האתנול על ידי שטיפת רכיבי ה-IChip במים נטולי יונים סטריליים, ואפשרו להם לייבש צלחת פטרי סטרילית באוויר. מניחים את הצלחת האמצעית של ה- IChip בצלחת פטרי סטרילית מוכנה לזריעה. ממיסים את מדיום האגר SMS במיקרוגל. הניחו לו להתקרר, ולאחר מכן העבירו 22.5 מ"ל של אגר SMS ב-45 מעלות לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מ"ל. לכך יש להוסיף 2.5 מ"ל של דילול מתאים של דגימת אדמה ולערבב היטב על ידי היפוך עדין תוך הימנעות מהכנסת בועות אוויר. יוצקים לאט כשלושה עד ארבעה מ"ל ממדיום האגר הזרוע של SMS על הצלחת האמצעית של ה-IChip המכסה את כל המשטח. לאחר מכן אפשר למדיום ה- SMS agar להתייצב למשך כחמש עד 10 דקות. בדוק אם מדיום ה-SMS agar מוגדר. לאחר מכן, בעזרת סכין הגילוח הסטרילי, מגרדים את אגר ה-SMS העודף מפני השטח של לוחית המתכת של IChip ומשאירים מאחור את תקעי האגר בתאי הדיפוזיה הבודדים. לאחר הסרת יריעת המגן מאחד ממסנני ממברנת הפוליקרבונט 0.03 מיקרומטר, הנח אותה בזהירות על החלק הפנימי של הלהב העליון של ה-IChip באמצעות מלקחיים סטריליים. לאחר מכן הנח מסנן קרום פוליקרבונט נוסף של 0.03 מיקרומטר על הצד החשוף של לוחית המתכת הזרע באמצעות מלקחיים סטריליים. הנח את הלוחות העליונים והתחתונים של ה-IChip, סנדוויץ' את הצלחת האמצעית ואת ממברנות הפוליקרבונט, והקפידו ליישר את חורי הברגים הללו בכל הלוחות כדי להשלים את מכלול ה-IChip. הדק היטב את האומים והברגים כדי לאבטח את מכלול ה-IChip. צור שקע גדול מגודל ה- IChip בקולט האדמה בקופסת הפוליסטירן באמצעות חפירה סטרילית. שתלו את מכלול ה-IChip בצורה אנכית בתוך השקע וארזו באדמה היטב וודא שכל משטחי ה-IChip מכוסים לחלוטין. לאחר מכן אפשר במקום בתרבית למשך הזמן הרצוי בין שבועיים לארבעה שבועות. במהלך הדגירה, השתמש במים מזוקקים סטריליים כדי להרטיב את סביבת האדמה, ה-IChip הנטוע, מעת לעת כדי למנוע את התייבשות פקקי ה-SMS agar הזרעים בתא הדיפוזיה. לאחר הדגירה הרצויה, עקור בעדינות את האדמה סביב ה-IChip הנטוע כדי לשחזר אותה. לאחר מכן שטפו את ה-IChip במי מלח סטריליים כדי להסיר חלקיקי אדמה דבקים ולהעביר אותו בתוך ארון בטיחות ביולוגית להמשך עיבוד. שחרר את האומים והבורג ממכלול ה-IChip ופרק בזהירות את ה-IChip. בעזרת מלקחיים סטריליים מסירים את ממברנות הפוליקרבונט ומעבירים את הצלחת האמצעית של ה- IChip לתוך צלחת הפטרי המוכנה. השתמש באפליקטור עץ סטרילי כדי לשחזר את פקקי האגר הבודדים בתוך כל תא דיפוזיה. חסנו את תקעי האגר למדיה מתאימה כמו אגר SMS או אגר מרק סויה טריפטי 0.1X כדי לנסות לגדל במעבדה. לאחר מכן ניתן לסנן מבודדים מעובדים לייצור אנטי-מיקרוביאלי בשיטות שגרתיות, כגון שכבת אגר באמצעות זני בודק. כאן אנו מציגים תוצאות סינון מייצגות עבור 12 תרביות, IC-1 עד 12 שהתקבלו מפקקי אגר IChip כנגד Staphylococcus aureus ATCC 29213 ו- Acinetobacter baumannii B8342. שימו לב שתרביות IC-6 ו-IC-8 מראות פעילות נגד זני בודק גרם חיוביים וגרם שליליים בהתאמה. לחלופין, הכתים והדמינו את פקקי האגר המשוחזרים המכילים חיידקי אדמה עקשנים מעובדים באתרם כדי לאשר צמיחה של מושבות מיקרו בתנאים באתר. באמצעות גישה זו, ניתן לשחזר חיידקי קרקע עקשנים באתרם באופן תפוקה גבוהה. ה-IChip המודפס בתלת מימד יכול להכיל 156 תקעי אגר. עם זאת, יש צורך לבחור את הדילול הנכון בזמן הזריעה כדי להבטיח שתא חיידקי אחד נזרע בכל תעלה של ה-IChip. לאחר מכן ניתן לסנן את החיידקים הנדרשים לפעילות ביולוגית רצויה, כגון ייצור מטבוליט, ייצור אנזימים, ייצור ביופולימרים וכו', אם ניתן לגדל אותם בתנאי מעבדה. עם זאת, סביר גם שחלק מהחיידקים עשויים שלא לגדול בתנאי מעבדה, ובמקרים כאלה, ייתכן שנצטרך לאמץ גישות מטגנומיות כדי לממש את הנוכחות המיקרוביאלית ולגשת לפוטנציאל הביו-סינתטי שלהם. השיטה המתוארת קלה מאוד וניתן להשתמש בה בקלות לחיפוש ביולוגי של חיידקים בתנאי סביבה מגוונים עם שינויים קלים.