Name: הדמיה נפחית וניתוח ריסים ראשוניים ברקמת שריר ושלד באמצעות מודל העכבר ARL13B-CENTRIN-2 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: חקור הדמיה תלת-ממדית של ריסים ראשוניים בלוחית הגדילה של עכבר ARL13B-CENTRIN-2. שיטה זו מאפשרת מיפוי מרחבי של ריסים בעצם וסחוס לחקר תהליכי מורפוגנזה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Wheatley, D. N., Wang, A. M., Strugnell, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+primary+cilia+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Expression of primary cilia in mammalian cells.</a> Cell Biol Int. 20 (1), 73-81 (1996).</li>
<li>Donnelly, E., Ascenzi, M. G., Farnum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+are+highly+oriented+with+respect+to+collagen+direction+and+long+axis+of+extensor+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Primary cilia are highly oriented with respect to collagen direction and long axis of extensor tendon.</a> J Orthop Res. 28 (1), 77-82 (2010).</li>
<li>McGlashan, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+loading+modulates+chondrocyte+primary+cilia+incidence+and+length%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Mechanical loading modulates chondrocyte primary cilia incidence and length.</a> Cell Biol Int. 34 (5), 441-446 (2010).</li>
<li>Farnum, C. E., Wilsman, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+primary+cilia+of+articular+chondrocytes+in+three-dimensional+space%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Orientation of primary cilia of articular chondrocytes in three-dimensional space.</a> Anat Rec. 294 (3), 533-549 (2011).</li>
<li>Coveney, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliary+protein+IFT88+controls+post-natal+cartilage+thickness+and+influences+development+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arth+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">The ciliary protein IFT88 controls post-natal cartilage thickness and influences development of osteoarthritis.</a> Arth Rheumatol. 74 (1), 49-59 (2021).</li>
<li>Coveney, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+IFT88+protects+coordinated+adolescent+growth+plate+ossification+from+disruptive+physiological+mechanical+forces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Ciliary IFT88 protects coordinated adolescent growth plate ossification from disruptive physiological mechanical forces.</a> J Bone Miner Res. 37 (6), 1081-1086 (2022).</li>
<li>Andrea, C. E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+organization+reflects+polarity+in+the+growth+plate+and+implies+loss+of+polarity+and+mosaicism+in+osteochondroma%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Primary cilia organization reflects polarity in the growth plate and implies loss of polarity and mosaicism in osteochondroma.</a> Lab Invest. 90 (7), 1091-1101 (2010).</li>
<li>Ascenzi, M. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+localization%2C+length+and+orientation+of+chondrocytic+primary+cilium+on+murine+growth+plate+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">Effect of localization, length and orientation of chondrocytic primary cilium on murine growth plate organization.</a> J. Theor Biol. 285 (1), 147-155 (2011).</li>
<li>Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+specificity+of+primary+cilia+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo.</a> Nat. Cell Biol. 17 (2), 113-122 (2015).</li>
<li>Larkins, C. E., Aviles, G. D. G., East, M. P., Kahn, R. A., Caspary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arl13b+regulates+ciliogenesis+and+the+dynamic+localization+of+Shh+signaling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Arl13b regulates ciliogenesis and the dynamic localization of Shh signaling proteins.</a> Mol Biol Cell. 22 (23), 4694-4703 (2011).</li>
<li>Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mouse+line+with+green-fluorescent+protein-labeled+Centrin+2+allows+visualization+of+the+centrosome+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells.</a> Transgenic Res. 13 (2), 155-164 (2004).</li>
<li>arivis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Application+Note+%2347+-+Applying+Cellpose+models+in+arivis+Vision4D%22">Application Note #47 - Applying Cellpose models in arivis Vision4D</a>. , 1-20 (2021).</li>
<li>Huff, J., Bergter, A., Luebbers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+Note%3A+Multiplex+mode+for+the+LSM+9+series+with+Airyscan+2%3A+fast+and+gentle+confocal+super-resolution+in+large+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Application Note: Multiplex mode for the LSM 9 series with Airyscan 2: fast and gentle confocal super-resolution in large volumes.</a> Nat Methods. , (2019).</li>
<li>Ning, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia-associated+wound+repair+mediated+by+IFT88+in+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cilia-associated wound repair mediated by IFT88 in retinal pigment epithelium.</a> Sci Rep. 13 (1), 8205-8219 (2023).</li>
<li>Palla, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+on+muscle+stem+cells+are+critical+to+maintain+regenerative+capacity+and+are+lost+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Primary cilia on muscle stem cells are critical to maintain regenerative capacity and are lost during aging.</a> Nat Commun. 13 (1), 1439-1451 (2022).</li>
<li>Brewer, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+dynamic+ciliary+ARL13B+and+ADCY3+localization+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Postnatal dynamic ciliary ARL13B and ADCY3 localization in the mouse brain.</a> Cells. 13 (3), 259-277 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>22 x 50 מ"מ כיסוי מחליקים</td><td>Fisherscientific&nbsp;</td><td></td><td></td>12373128</tr><tr><td>אריביס תוכנת Vision4D</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>תוכנה לניתוח תמונה&nbsp;</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss 980 Airyscan 2</td><td></td></tr><tr><td>CoverGrip איטום כיסוי&nbsp;</td><td>ביוטיום&nbsp;</td><td>23005</td><td></td></tr><tr><td>Cryofilm סוג 3C(16UF) (סוג גיליון) רוחב 2.0 ס"מ</td> מעבדת <td>חתך</td><td>C-FUF303</td><td>לרכישה ישירות ממעבדת חתך</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1900 UV</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>תבניות בסיס חד פעמיות&nbsp;</td><td>epredia</td><td>58952</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Sa Salt</td><td>gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Sigma</td><td>20260630</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת Imaris&nbsp;</td><td>אוקספורד אינסטרומנטס&nbsp;</td><td>תוכנה</td><td>לניתוח תמונות לשחזור תלת מימד&nbsp;</td></tr><tr><td>שמן טבילה 518F</td><td>Zeiss</td><td>ISO 8036&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>להבי מיקרוטום</td><td>נוצה</td><td>02.075.00.006</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade זכוכית Antifade תושבת&nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>S36917</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>סופר Cryoembedding בינוני (SCEM)</td> <td>מעבדת מדור</td><td>C-EM001</td><td>לרכישה ממעבדת מדור ישירות</td></tr><tr><td>Superfrost Plus מיקרוסקופ שקופיות</td><td>avantor</td><td>631-0108</td><td></td></tr><tr><td>Zen software</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>תוכנה חינמית למיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית</td></tr></tbody></table>

הדמיה נפחית וניתוח ריסים ראשוניים ברקמת שריר ושלד באמצעות מודל העכבר arl13b-centrin-2

Volumetric Imaging and Analysis of Primary Cilia in Musculoskeletal Tissue using the ARL13B-CENTRIN-2 Mouse Model

לוחית הגדילה של עכבר בן 6 שבועות צולמה באמצעות הפרוטוקול המתואר וארגון הריסים הראשוני שמופו ברקמה. תמונה של כל שלושת האזורים של לוחית הגידול - מנוחה, שגשוג והיפרטרופית - נלכדה והועברה דרך צינור הניתוח (איור 2A). ניתן לזהות תאים בודדים עם צביעת DAPI, עם האקסונם הריסי שלהם באדום והצנטריולים שלהם בירוק. הרזולוציה בשיטה זו גבוהה מספיק כדי להבחין בין צנטריולים בודדים (איור 2B). ברזולוציה זו, ניתן לדמיין את הריסים בסביבה התלת-ממדית שלהם, כשהם מצביעים לכיוונים שונים (וידאו 1).
ניתן גם לצלם תמונות ברזולוציה נמוכה יותר, עם יעדי הגדלה גבוהים יותר, כדי לדמיין ריסים ראשוניים על פני אזור גדול יותר של רקמה; עם זאת, אלה אינם מתאימים לניתוח אוריינטציה של ריסים בתלת מימד. לדוגמה, הריסים הראשוניים בסחוס המפרקי צולמו עם המטרה פי 20, מה שמדגים שהשיטה עובדת גם על רקמות אחרות (איור 2C). ברזולוציה זו ניתן לזהות את האקסונמים הריסים באדום, אך קשה יותר להבחין בין הצנטריולים. עצם תת-כונדרלית נוטה להציג הרבה אות רקע של GFP, מה שמקשה על זיהוי הצנטריול ברקמה זו.
הצינור יכול לזהות תאים בודדים, ריסים ראשוניים וצנטריולות, והוא עובד עבור לוחיות גדילה צעירות מאורגנות מאוד ולוחות גדילה מבוגרים יותר שבהם העמודות מוגדרות פחות טוב, כמו בעכברים בני 10 שבועות (איור 3). תאים וריסים מזוהים בתלת מימד, כפי שניתן לראות על פני מחסנית ה-z.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67693/67693fig01.jpg"> 
איור 1: זרימת עבודה ניסיונית. תרשים זרימה של השלבים השונים בפרוטוקול מאיסוף רקמות ועד ניתוח תמונה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/67693fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67693/67693fig02.jpg"> 
איור 2: ריסים ראשוניים ברקמות עכברים של עכבר ARL13B-CENTRIN-2. (A) לוחית גדילה בת 6 שבועות, עם DAPI בלבן, CENTRIN-2 בירוק ו-ARL13B באדום, בתמונה עם המטרה פי 40. (B) התקרב לריסים ראשוניים בודדים ולשני הצנטריולים שלו. (C) סחוס מפרקי ועצם תת-כונדרלית של עכבר בן 4 שבועות, בתמונה עם המטרה פי 20. (D) כליה של עכבר בן 6 שבועות שצולמה באמצעות אותו צינור כמו של רקמת שריר ושלד. (E) הגדלה של הקופסה הלבנה ב-D המציגה ריסים ראשוניים בודדים והצנטריולים שלהם בכליה. פסי קנה מידה = 20 מיקרומטר (A,D), 4 מיקרומטר (B), 60 מיקרומטר (C), 6 מיקרומטר (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/67693fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67693/67693fig03.jpg"> 
איור 3: צינור זיהוי תאים וריסים. יישום לדוגמה של צינור ניתוח התמונה על לוחית גידול בת 10 שבועות. (א) תמונה שנפתחה בתוכנה. (ב) תוצאה של צינור זיהוי התאים. (ג) תוצאה של צינור גילוי הריסים והצנטריולים. ריסים בוורוד וצנטריולים בירוק. מבט הצד מדגים שהרזולוציה גבוהה מספיק כדי להבחין בין ריסים המכוונים לכיוונים שונים בתלת מימד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/67693fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
סרטון 1: שחזור תלת מימדי של לוחית גדילה בת 6 שבועות מעכבר ARL13B-CENTRIN-2. השחזור התלת מימדי בוצע בתוכנת אימאריס והוקלט כסרטון אנימציה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/Video-1.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.</a>
איור משלים S1: הגדרות רכישת תמונה במערכת המיקרוסקופ. (A) חלון הגדרה חכמה כדי להוסיף את הערוצים ולבחור במצב Airyscan . (B) מציג אריחים כדי לבחור ולהציג תצוגה מקדימה של האריחים לתמונה. (C) חלון כוונון גלאי Airyscan , שבו יישור גלאי Airyscan מאושר ברגע שכל האריחים הופכים לירוקים. (D) הגדרות לייזר עבור שלושת הערוצים. (ה) הגדרות מצב רכישה ו-Z-Stack. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/Supp-file-1.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
איור משלים S2: הגדרות עיבוד תמונה במערכת המיקרוסקופ. (א) הגדרות עיבוד Airyscan. (ב) הגדרות תפירה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/Supp-file-2.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
איור משלים S3: צינורות ניתוח תמונות מותאמים אישית. (A) צינור זיהוי תאים באמצעות ערוצי GFP ו-DAPI. (B) צינור זיהוי ריסים וצנטריולה ראשוניים באמצעות ערוצי mCherry ו-GFP, בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/Supp-file-3-.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>

הדמיה נפחית וניתוח ריסים ראשוניים ברקמת שריר ושלד באמצעות מודל העכבר ARL13B-CENTRIN-2

The primary cilium is a non-motile, solitary organelle assembled by most cell types. It is essential to the development and homeostasis of the skeleton ...

כדי להבין טוב יותר את הגפה הגדלה, חקרנו את הריסים הראשוניים, אברון הממלא תפקיד מפתח בוויסות תגובת התאים לסביבתם. כדי לחקור את תפקידו של הסיליום בגדילה, אנו מדמים אותם בתוך לוחית הגדילה, שכבת סחוס שבה צומחת עצם חדשה. הריסים הראשוניים קטנים מאוד, אורכם פחות מחמישה מיקרומטרים, מה שהופך אותו למאתגר לצילום, במיוחד בתלת מימד.הדמיה שלו בתוך רקמות עשירות במטריצות ומסויידות חלקית, כמו סחוס ועצם, רק הופכת את החקירה המדויקת של נוכחותם, שלא לדבר על מיקום, אוריינטציה וגודל, לקשה עוד יותר. אנו יכולים למפות את הארגון התלת-ממדי של ריסים ראשוניים בכל התאים בתוך לוחית הגידול, ולשאול אם תאים חולים מרכיבים אחד היכן וכיצד הוא מכוון ביחס למורפוגנזה של רקמות. ריסים ראשוניים נחקרו בעבר רק בדו-ממד בלוחות גדילה או במספרים קטנים מאוד.האותות הפלואורסצנטיים האנדוגניים עבור הסיליום והצנטריולים מביאים ביטחון בזיהוי הריסים בגלל האות הגבוה לרעש ומונעים את הצורך באימונוהיסטוכימיה. פרוטוקול זה מאפשר גם הדמיה קולקטיבית בתפוקה גבוהה של מאות ריסים ברקמה, ומאפשר לנו לקשר מרחבית ריסים לאירועי המורפוגנזה שאנו חוקרים. ניתן ליישם מתודולוגיית הדמיה וניתוח זו על רקמות אחרות על מנת למפות ריסים ראשוניים על פני רקמות ואיברים.זה יאפשר הבנה טובה יותר של הקשר בין מבנה הריסים הראשוניים לתפקודם. כדי להתחיל, קח את קטע הקריו הקפוא המוכן של רקמת העכבר והנח את השקופית אופקית בטמפרטורת החדר להפשרה. שטפו את השקופית באמצעות טיפת PBS למשך שלושה מחזורים של חמש דקות כל אחד כדי להסיר את הזיוף.מרחו תמיסת DAPI של 10 מיקרומולרית על השקופית והכתמו למשך דקה אחת. לאחר מכן הרכיב את הדגימה, כסה אותה בהחלקת כיסוי והשאיר אותה בטמפרטורת החדר למשך הלילה. אטום את שולי החלקת הכיסוי באמצעות איטום החלקת כיסוי.כדי להגדיר את המיקרוסקופ הקונפוקלי, הפעל אותו, פתח את התוכנה ולחץ על כפתור המערכת. תחת הכרטיסייה רכישה, לחץ על הגדרה חכמה כדי להגדיר את הערוצים ולהוסיף את ערוצי GFP, mCherry ו-DAPI. לאחר מכן בחר באפשרות סריקת ARI ובפונקציה sR8-Y ממשולש סריקת ARI בין רזולוציה למהירות.לחץ על האות הטוב ביותר ולאחר מכן על אישור כדי לאשר. בכרטיסייה אתר תחת בקרת מיקרוסקופ, בחר את המטרה 40 פעמים ו-1.4 עם טבילת שמן. לאחר מכן, הנח את השקופית במחזיק השקופיות והעלה את המטרה עד שהשמן נוגע בהחלקת הכיסוי.לאחר מכן מקם את לוחית הצמיחה, או אזור עניין אחר, מתחת לנתיב האור. בכרטיסייה אתר, לחץ על פלואורסצנטי ובחר DAPI. ובאמצעות העינית, הזז את מחזיק השקופית עם הג'ויסטיק כדי למקם את לוחית הצמיחה, או אזור העניין, מתחת לשדה הראייה.בכרטיסייה רכישה, בחר רק את ערוץ ה- DAPI. לחץ על רציף כדי view התמונה של ערוץ DAPI על המסך ולוודא שלוחית הצמיחה נראית לעין. כדי לפתוח את מציג האריחים, לחץ על הצג מציג בכרטיסיה אריחים.הוסף את מספר האריחים הנדרש, בדרך כלל אריח אחד בכיוון X ושלושה עד חמישה אריחים בכיוון Y. לאחר מכן לחץ על תצוגה מקדימה והתחל. כעת בדוק שהאריחים מכסים את שלושת האזורים של לוחית הצמיחה, מנוחה, התפשטות והיפרטרופיה.התאם את המיקום והמספר של האריח במידת הצורך. כדי להגדיר את פרמטרי התמונה, בכרטיסייה רכישה, לחץ על רציף. כדי ליישר את גלאי הסריקה של ARI, פתח את חלון התאמת גלאי הסריקה של ARI על ידי לחיצה על סמל הרוזטה המרוצף בתחתית.המתן עד שכל האריחים יהפכו לירוקים. בכרטיסייה ערוצים, כוונן את מאסטר ההגברה ואת עוצמת הלייזר כדי להציג בבירור את הגרעינים על המסך. לאחר מכן, בחר את כל שלושת הערוצים ולחץ על רציף כדי להתחיל בהדמיה.אפשר לגלאי הסריקה של ARI להתיישר. בכרטיסייה Acquisition Mode, הגדירו את גודל התמונה, גודל הפיקסלים, גודל המסגרת, המהירות וערכי הממוצע. בכרטיסיה ״רכישה״, בחר/י בתיבת הסימון Z-Stack כדי להפעיל הדמיה של Z-stack.לאחר מכן בחר רק את ערוץ ה- DAPI ולחץ על רציף כדי להציג את התמונה על המסך. הזז את המטרה למטה למישור הקרוב ביותר לצילום. בכרטיסייה Z-Stack, לחץ על הגדר מישור ראשון, ולאחר מכן התמקד הרחק למישור האחרון לצפייה ולחץ על הגדר מישור אחרון כדי להגדיר את טווח ההדמיה.הגדר את המרווח בין מישורי Z-stack ל-0.15 מיקרומטר. עבור למרכז טווח ההדמיה של Z-stack. בכרטיסייה אריחים תחת אזורי אריחים, לחץ על אימות ולאחר מכן על הגדר Z ועבור להבא.כעת, בכרטיסיה אסטרטגיית מיקוד, אשר שאסטרטגיית המיקוד מוגדרת להשתמש בערכי Z ובמשטח המיקוד שהוגדרו בהגדרת האריח. לאחר מכן לחץ על התחל ניסוי כדי להתחיל ברכישת תמונות. כדי לעבד את התמונות, עבור לכרטיסייה עיבוד, בחר מצב יחיד או אצווה, בחר עיבוד סריקה של ARI, סמן את עיבוד תלת מימד אפשרות ובחר מסנן אוטומטי סטנדרטי.בחר את התמונה הגולמית שנרכשה והתחל בעיבוד. לאחר השלמת עיבוד סריקת ARI, בחר תפירה בשיטות העיבוד. בחרו 'פלט חדש', 'נתיך אריחים', 'הצללה נכונה' ו'הכל לפי הפניה', כשההפניה מוגדרת כ-DAPI.בחר את התמונה המעובדת של סריקת ARI והתחל בתהליך התפירה. כדי להתחיל, ייבא את קובץ התמונה CZI שנרכש לתוכנה ופתח את לוח הניתוח. בתפריט הנפתח, בחר קו צינור חדש.השתמש בלחצן הוסף פעולה כדי להוסיף אופרטורים לקו הצינור. כדי ליצור צינור זיהוי תאים, ייבא את פלח פוסט התא של Python לתוך הצינור. הגדר את שם הדגם ל-Cyto 2, ערוץ קלט ל-2, ערוץ שני ל-3, קוטר במיקרומטר ל-10.סף הזרימה ל-0.4 וסף ההסתברות לתא ל-0. לאחר מכן, הוסף אופרטור של אובייקטי מסמך ייבוא לפני קו הצינור ושנה את שמו לייבוא תוויות ידניות. לאחר מכן הוסף אופרטור מסנן תכונות אובייקט לאחר קו הצינור ושנה את שמו למסנן גודל.צייר אזור עניין בעזרת הכלי מצולע במישור הראשון ובמישור האחרון. שנה את שם האובייקט שנוצר ותייג אותו. לחץ על החץ הכחול קדימה בחלק העליון של לוח הניתוח כדי להפעיל את הצינור.כדי ליצור קו צינור ראשי לזיהוי ריסים וצנטריולים, פתח את לוח הניתוח ובחר קו צינור חדש מהתפריט הנפתח. הוסף והתאם אופרטורים כגון אובייקטי מסמך ייבוא, שני אופרטורים של סף, פיצול, אובייקט, תכונה, מסנן ותא לקו הצינור. לאחר מכן לחץ על החץ הכחול קדימה בחלק העליון של לוח הניתוח כדי להפעיל את הצינור.פתח את חלון האובייקטים, בחר את האובייקט המכיל את התאים, הריסים הראשיים והצנטריולות, כאן נקרא תא תא, ולחץ על ייבוא/ייצוא. בחר ייצוא Excel. בחר את התכונות כגון מספר צאצאים, שם, שמות הורים, צד קצר כרוך בכיוון תלת מימד, צד אמצעי, צד ארוך, זווית XY, זווית XZ, זווית YZ, תיבה תוחמת X1, X2, Y1, Y2, Z1, Z2, גודל X, גודל Y, גודל Z, מרכז הגיאומטריה X, Y, Z, מישור ראשון, אחרון, ספירה, רשת, רשת נפח ורשת שטח פנים לשמירה.ארגון הריסים הראשוניים מופה בהצלחה בצלחת הגדילה של עכבר בן שישה שבועות. הדמיה ברזולוציה גבוהה הדגימה את היכולת לדמיין צנטריולים בודדים וריסים ראשוניים בסביבתם התלת מימדית. תאים וריסים ראשוניים מתגלים בתלת מימד באמצעות צינור ניתוח התמונה, שיכול להבדיל בין ריסים ראשוניים המצביעים לצד לבין אלה המצביעים לאחור.

volumetric-imaging-analysis-primary-cilia-musculoskeletal-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

טכניקה קלה ואמינה המאפשרים הדמיה וכימות תנועתיות ריסי דרכי הנשימה וזרימת ריסים נוצר באמצעות עכבר קנה הנשימה מתוארת. יכולה להיות שונה בטכניקה זו כדי לקבוע כיצד מגוון רחב של גורמים המשפיע על תנועתיות ריסים, כולל סוכנים תרופתיים, גורמים גנטיים, חשיפות סביבתיות, ו / או גורמים מכאניים כגון עומס ריר.

שיטת vivo לשעבר להדמיה ברזולוציה גבוהה של תנועתיות צילה במכרסמי Airway epithelia

ריסים של נוירונים חושי ריח מכילים חלבונים של מפל העברת האותות, אך ניתוח מרחבי מפורט של התפלגותם קשה בהקפאות. אנו מתארים כאן גישה אופטימלית לתיוג הר שלם והדמיה פנים של חלבונים ריסניים.

הר תיוג כל צילה במערכת חוש הריח העיקרית של עכברים

ריסים ראשוניים משפיעים על מסלולי איתות שונים. שבלול היונקים אידיאלי לבחינת איתות קוטביות תאים מישוריים (PCP). תפקוד לקוי של ריסים משפיע על צמיחת השבלול, דפוס התאים וכיוון תאי השערה, קריאות של PCP. מטרתנו היא לנתח איתות PCP בשבלול עכבר באמצעות ניתוח פנוטיפי, אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

הערכת פנוטיפים מישורים-Cell-קוטביות ב Ciliopathy עכבר Mutant שבלול

כתב יד זה מציג שיטות לניתוח morphometric, שינויים סלולריים בתוך בעצם הלסת של מכרסמים.

Morphometric ושיטת ניתוח הסלולר עבור המפרקתי הנמוך מאתר הלסת

לאחרונה אנחנו ממופה המיקומים מרחבי תלת מימדי (3D) של נתיבי תחבורה חלבונים שונים translocating בתוך ראשי cilia בתאים חיים. כאן זה פרטים נייר את הגדרת הניסוי, התהליך של דגימות ביולוגיות, הניתוחים נתונים עבור קרינה פלואורסצנטית הרזולוציה סופר 3D הדמיה הגישה לאחרונה המוחלת בחיים cilia העיקרי.

יישום של מיקרוסקופיית מהירות רזולוציה סופר מהיר ב ריסי העיקרי בשידור חי

סיליה העיקרית היא מבנים extracellular הקשורים centriole. זיהוי cilia ראשוני על ידי כתם immunofluorescent הוא הליך פשוט יחסית שתוצאות תמונות באיכות גבוהה מאוד. בפרוטוקול זה, פיברובלסטים המבטאים cilia ראשוני תוקנו, immunostained, ותמונה במיקרוסקופ פלורסנט או confocal.

זיהוי פשוט של Cilia הראשי על ידי אימונולוסץ

פרוטוקול זה מתאר את הזיהוי של נדידת תאי גזע שלד periosteal בתיווך CCL5 בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה תוך-וינטלית חיה של בעלי חיים.

הדמיה בזמן אמת של הגירה הנגרמת על ידי CCL5 של תאי גזע שלד Periosteal בעכברים

השימוש בבינה מלאכותית (Ai) לניתוח תמונות מתגלה כגישה חזקה, פחות מוטה ומהירה בהשוואה לשיטות נפוצות. כאן אימנו את Ai לזהות אברון תאי, ריסים ראשוניים, ולנתח תכונות כגון אורך ועוצמת הכתמים באופן קפדני ושחזורי.

גישות בינה מלאכותית להערכת ריסים ראשוניים

אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים ליצירה ואפיון של תאים גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים המושרים על ידי בני אדם (hIPSC) מודלים מבוססי התפתחות ניאוקורטית, כמו גם מתודולוגיות משלימות המאפשרות ניתוח איכותי וכמותי של ביוגניזיס סיליום ראשוני (PC) ותפקוד.

מודלים מבוססי תאי גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים אנושיים לניתוח מעורבות סיליום ראשוני במהלך התפתחות ניאוקורטיקלית

הפרוטוקולים הנוכחיים מתארים הדמיה חדשה של הר שלם להדמיית מבנים היקפיים בעדשת העין עם שיטות לכימות תמונה. פרוטוקולים אלה יכולים לשמש במחקרים כדי להבין טוב יותר את הקשר בין מבנים מיקרוסקולריים של עדשה לבין התפתחות/תפקוד עדשה.

הדמיה של תושבת שלמה כדי להמחיש ולכמת את מבנה העדשה ההיקפית, המורפולוגיה של התא והארגון

כאן, אנו מתארים לעומק שיטה, המבוססת על טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת, לפלח ולמדוד מודלים תלת-ממדיים של עצמות קרניומקסילופציאליות בעכברים, להערכה טובה יותר של התפתחות עצם קרניומקסילופציאלית בעכברים ממה שמתאפשר בשיטות הנוכחיות.

ניתוח מומים קרניומקסילופציאליים בעכברים באמצעות טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת תלת מימדית

חקור הדמיה תלת-ממדית של ריסים ראשוניים בלוחית הגדילה של עכבר ARL13B-CENTRIN-2. שיטה זו מאפשרת מיפוי מרחבי של ריסים בעצם וסחוס לחקר תהליכי מורפוגנזה.

הדמיה נפחית וניתוח ריסים ראשוניים ברקמת שריר ושלד באמצעות מודל העכבר ARL13B-CENTRIN-2

גלה סרטונים נוספים