תאי פסגה עצבית גולגולתית פרוטוקול התמיינות תלת מימדי במבחנה לבדיקה מרובבת

אנו מעוניינים להבין כיצד החלטה מסוימת מווסתת במהלך הפיתוח. מודלים אורגנואידים וטכנולוגיות סינגל-צלומיקה מאפשרים לנו לשאול שאלות שלא היו אפשריות בעבר. השימוש במודלים אורגנואידים במבחנה מאפשר לנו לייצר כמות גדולה יותר של נתונים, במיוחד עבור אוכלוסיות תאים חולפות, כגון הפסגה העצבית.

תפוקות מודל השונות המשמעותיות נותרו אתגר ניסיוני גדול. הראינו שתאי פסגת הגולגולת מבטאים מחדש גנים של קדם-פוטנטיות כדי להרחיב את פוטנציאל ההתמיינות. כדי להתחיל, הכינו תמיסת קולגנאז טרייה בריכוז של שני מיליגרם למיליליטר במדיום הנוקאאוט DMEM.

שאפו את מדיום ה-ESC מלוח הבאר המכיל 70 עד 80% mESC קונפלואנט. כעת, הוסף בעדינות מיליליטר אחד של PBS לצד הבאר. נדנד את הצלחת כדי להבטיח כביסה אחידה.

הוציאו את ה-PBS והחליפו אותו בשני מיליליטר תמיסת קולגנאז. דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 45 דקות. בדוק את הצלחת תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 10 לאחר 20 דקות של דגירה, ולאחר מכן כל חמש דקות.

כאשר המושבות מראות קצוות מגולגלים, הקש במרץ על צד הצלחת כדי לנתק את המושבות. בעזרת פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר, אספו את המושבות המנותקות והעבירו אותן לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. צנטריפוגה את המושבות ב -16 גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.

שאפו כמה שיותר מדיום מהצינור החרוטי מבלי להפריע למושבות בתחתית. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של תמיסת טריפסין 0.05% לגלולה ודגירה. עם מיקרו-פיפטות P1000 ו-P200, פיפטה את התרחיף למעלה ולמטה במרץ כדי לנתק את המושבות, ואז להוסיף שני מיליליטר של מדיום תרבית mESC כדי לחסום את הטריפסין.

צנטריפוגה את הצינור בחום של 160 גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. פיפטה החוצה את הסופרנטנט, ואז הוסף מיליליטר אחד של מדיום התמיינות CNCC. ספרו את התאים בעזרת מכשיר אוטומטי לספירת תאים או תחת מיקרוסקופ, ולאחר מכן דללו תאים במדיום התמיינות CNCC כדי להשיג ריכוז של 3,000 תאים חיים לכל 50 מיקרוליטר.

עם מיקרופיפטה P200, זרע 50 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל באר של צלחת 96 בארות עם תחתית U שאינה מטופלת ב- TC. מלאו כל באר ל-200 מיקרוליטר במדיום התמיינות CNCC ודגרו. התבונן בצלחת המכילה תרבית 24 שעות של תאים מובחנים תחת מיקרוסקופ אור כדי להבטיח שאשכולות קטנים עם גבולות ברורים נראים בתחתית כל באר.

החזירו את הצלחת לחממה למשך הלילה. ביום השני, הסר לאט לאט 100 מיקרוליטר מדיום מכל באר. לאחר מכן, השתמש במיקרופיפטה P200 כשקצהו חתוך שלושה עד ארבעה מילימטרים מהקצה כדי לשאוב את הנוירוספרות יחד עם המדיום הנותר.

העבירו את הנוירוספרות והמדיום הנותר לצלחת עם תחתית שטוחה של 96 בארות שאינה מטופלת ב-TC. ודא את ההעברה תחת מיקרוסקופ אור. מעל כל באר ל-200 מיקרוליטר של מדיום התמיינות CNCC שחומם מראש.

ביום הרביעי יש לשאוב 100 מיקרוליטר בינוני מכל באר. החלף אותו ב -100 מיקרוליטר של מדיום התמיינות CNCC שחומם מראש, ולאחר מכן דגר שוב. בימים החמישי והשישי, בדקו את החיבור של הנוירוספרות תחת מיקרוסקופ אור.

ודא שתאים קלים יותר המתפרקים מהנוירוספרות יתחילו להקיף את גופו העיקרי. הכן את אמצעי התחזוקה של CNCC לפי ההרכב הנתון. סנן אלבומין בסרום בקר דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר לפני הוספתו למדיום.

לאחר הוספת גורמי גדילה, אחסן את המדיום בארבע מעלות צלזיוס למשך עד שלושה שבועות, וודא שהוא מוגן מפני אור. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת פיברונקטין לכל באר של צלחת 96 בארות שאינה מטופלת ב-TC. בזמן שהצלחת נחה, שאפו כמה שיותר מדיום התמיינות CNCC מהבארות של צלחת 96 בארות עם תחתית שטוחה שאינה מטופלת ב-TC.

החלף את המדיום ב -50 מיקרוליטר Accutase. דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של אמצעי תחזוקה CNCC לכל באר כדי להרוות את ה-Accutase.

הסר פיברונקטין מהבארות המצופות של הצלחת המקבלת. לאחר מכן סנן את ה-CNCC המנותק לאחר הנדידה דרך מסנן של 40 מיקרומטר לבארות הצלחת המקבלת. בנקודת הזמן הרצויה, השתמש במיקרו-פיפטה P200 עם קצה חתוך כדי להעביר נוירוספרות מהצלחת של 96 בארות לתוך צינור של שני מיליליטר בעל קשירה נמוכה של DNA.

לאחר שנתנו לנוירוספרות להתיישב בצינור במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר, פיפטה החוצה כמה שיותר מדיום, ואז שטפו עם מיליליטר אחד של PBS קר. להכנת תאי הרכבה, הניחו שלוש שכבות של סרט שקוף דו צדדי ללא סיבים על שקופית מיקרוסקופ. בעזרת סכין גילוח, חותכים חלון של שלושה מילימטר על שמונה מילימטר בסרט הדו-צדדי.

תחת סטריאוסקופ, עם קצה חתוך P200, פיפטה בזהירות את הנוירוספרות בחומר הפינוי לתוך תא ההרכבה. השתמש בהגדלות בין 2X ל-4X כדי לספק שדה ראייה של החדר כולו ולזהות את הנוירוספרות. הנח החלקת כיסוי על משטח החדר ולחץ קלות על דפנותיו כדי להדביק אותו.

תרביות נוירוספרה בצלחות שאינן רקמות הראו חיבורים אחידים החל מהיום החמישי, בעוד שתרביות צלחות פטרי הראו התקשרות משתנה ואיחוי של נוירוספרות, ניכר במיוחד ביום הרביעי. שונות הגודל של נוירוספרות הופחתה משמעותית בתרביות צלחות של 96 בארות בהשוואה לתרביות צלחת פטרי בימים הרביעי והשביעי. קוטר הנוירוספרות בלוחות של 96 בארות נע בין 139 מיקרומטר ל-295 מיקרומטר ביום הרביעי ו-383 מיקרומטר ל-552 מיקרומטר ביום השביעי, בעוד שתרביות צלחות פטרי הראו טווח רחב יותר.

צמיחת הנוירוספרה הייתה אקספוננציאלית במונחים של מספר תאים, וגדלה מממוצע של 1,082 תאים ביום השני ל-48,352 תאים ביום התשיעי. צמיחת הקוטר הייתה ליניארית, וגדלה מממוצע של 136 מיקרומטר ביום השני ל-570 מיקרומטר ביום התשיעי. ניתוח אימונופלואורסצנטי אישר כי נוירוספרות ותאים דלמינציה מבטאים סמני CNCC AP2 אלפא ו-SOX9 וסמן EMT TWIST1 בימים התשיעי וה-13.

PAX7 היה קיים רק בנוירוספרות.