אפיון שלפוחיות חוץ-תאיות מנוזלים ביולוגיים
28 בפברואר 2025
כאן, אנו מדגימים את שיטת האפיון של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) שנאספו מנוזלים ביולוגיים, כגון דמעות ורוק, של נבדקים אנושיים. הסורק המשמש בשיטה זו מסוגל לזהות את הפנוטיפ, הגודל וספירת החלקיקים הכוללת של EVs מ-1 מיקרוליטר של הדגימה.
שלפוחיות חוץ-תאיות משמשות כסמנים ביולוגיים של מחלות, המשקפות מצבים פיזיולוגיים. הגישה שלנו מאפשרת חילוץ נתונים עשיר מנפחי דמעות זעירים, ומקדמת את מחקר EV בנוזלים ביולוגיים. אתגרי הניסוי העיקריים כוללים השגת ריכוזי שלפוחית חוץ-תאיים מספיקים מדגימות קטנות, מזעור אובדן דגימה במהלך הבידוד ואופטימיזציה של הניתוח כדי למנוע רוויית יתר של השבב או זיהוי אותות חלש.
פרוטוקול זה עוקף את שלבי הבידוד, מפחית את זמן העיבוד, ומאפשר ניתוח שלפוחיות חוץ-תאיות מנפחי דגימה קלים, מה שהופך אותו לאידיאלי עבור דגימות ביולוגיות מוגבלות, כמו קרעים. סמנים ביולוגיים לא פולשניים חיוניים לגילוי מוקדם וניהול של הפרעות בקרנית. סמנים ביולוגיים של שלפוחית חוץ-תאית מאפשרים ניטור מחלות, טיפולים מותאמים אישית, היענות טובה יותר למטופלים ואיכות חיים משופרת.
המעבדה שלנו הייתה חלוצה בניתוח שלפוחיות חוץ-תאיות בדגימות דמעות מנבדקי KC, וזיהתה חתימות tEV ייחודיות. זה סולל את הדרך לאבחון עתידי ויעדים טיפוליים ממוקדי EV. כדי להתחיל, הציבו את הדגימות הביולוגיות ושבב טטרספנין בסביבת העבודה.
פיפטה 70 מיקרוליטר של דגימות ביולוגיות אנושיות שעורבבו מראש עם תמיסה B של ערכת טטרספנין אנושית על שבב. הנח את הסרט על צלחת שטיפת שבבים כדי למנוע אידוי דגימה. לאחר 16 שעות, הניחו את הצלחת במכונת הכביסה
.נעל אותו במקומו וסגור את המכסה. לחץ על האפשרות CW-TETRA v0 במכונת הכביסה. בזמן שטיפת השבבים, הכינו 300 מיקרוליטר של תמיסת חסימה לכל שבב.
הוסף 0.6 מיקרוליטר מכל נוגדן לכל שבב לתמיסת החסימה. מערבל את תמיסת החסימה עם קוקטייל הנוגדנים כדי להבטיח ערבוב יסודי. בסיום שטיפת השבבים, הוסף 250 מיקרוליטר של תמיסת החסימה עם קוקטייל הנוגדנים על גבי כל שבב.
לאחר מכן סגור את המכסה ולחץ על המשך. כאשר מכונת הכביסה מצייצת, הסר את צלחת שטיפת השבבים. הזיזו את הצ'יפים במעלה הרמפה.
הנח את הצלחת בחזרה לתוך מכונת הכביסה, וודא שהיא ננעלת היטב במקומה. סגור את המכסה ולחץ על המשך. כדי להתחיל, הפעל מנתח ננו-חלקיקים.
הפעל את תוכנת הסריקה על שולחן העבודה המחובר למנתח הננו-חלקיקים. בחר את תיקיית השבבים כדי לבחור כל שבב טטרה-ספנין ואתר אותו במיקום השבב על הצ'אק. לחץ על שלושת הריבועים מתחת למיקום השבב כדי להפעיל את הקרינה.
הריבועים יהפכו לצהובים, כחולים ואדומים. לחץ על מכסה הצ'אק ומשוך אותו כדי להסיר אותו. לאחר מכן אבטח היטב את שבבי הטטרספנין העמוסים בדגימה על הצ'אק.
יישר את יתדות מכסה הצ'אק עם החורים ולחץ כלפי מטה. החלק את המכסה כדי לנעול אותו במקומו. לאחר מכן הנח את הצ'אק על הבמה ונעל אותו במקומו.
לאחר מכן, לחץ על סרוק שבבים מממשק התוכנה, ולאחר מכן לחץ על אישור. לאחר שה-stage עובר במלואו למכונה, סגור את הדלת. בסיום הסריקה, פתח את הדלת כדי להוציא את ה-stage ולוודא את התוצאות. אם הסריקות הצליחו, השליכו את השבבים.
הניחו את סט הצ'יפס הבא על הצ'אק. לחלופין, החזירו את הצ'אק הריק לבמה. צא מהתוכנה וכבה את המכשיר בסיום.
רמות פלואורסצנטיות אופטימליות של שלפוחיות חוץ-תאיות נצפו בערוצי CD63, CD81 ו-CD9, בעוד שערוץ הבקרה MIgG נותר שחור, מה שאישר את ספציפיות הבקרה. CD81 הופחת עבור נוזלים ביולוגיים. אין פלואורסצנטיות בתעלות CD63, CD81 ו-CD9 מעיד על היעדר שלפוחיות חוץ-תאיות.
רוויית יתר של הקרינה הייתה ניכרת, מה שהקשה על הבחנה בנתונים משמעותיים עקב תיוג מוגזם, במיוחד בערוצי CD63, CD81 ו-CD9.
סקירה
מחקר זה מציג שיטה חדשה לאופיינות של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) שנאספו מנוזלי גוף ביולוגיים אנושיים, כגון קרם ורוק. על ידי שימוש בשבב טטרספנין, הגישה מאפשרת את הניתוח של EVs מנפחי דגימה מינימליים, ומקדמת את המחקר של סמנים ביולוגיים לא פולשניים למעקב אחר מחלות.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המחקר
- שלפוחיות חוץ-תאיות
- סמנים ביולוגיים לא פולשניים
- מחלות עיניים
רקע
- EVs משמשים כמדדים של מצבים פיזיולוגיים ומחלות
- האתגרים כוללים ריכוזים נמוכים בדגימות קטנות וזמן עיבוד הדגימה
- חשיבות הגילוי המוקדם של הפרעות בקרנית
שיטות בהן נעשה שימוש
- שימוש בשבב טטרספנין לניתוח EV
- דגימות ביולוגיות אנושיות (קרם)
- גילוי מבוסס פלואורסצנציה של סמני EV CD63, CD81 ו-CD9
תוצאות עיקריות
- אינטגרציה של שלבי הכנת הדגימה והניתוח מפחיתה את זמן העיבוד
- רמות הפלואורסצנציה של סמני EV מאששות את הספציפיות והנוכחות
- זיהוי של חתימות tEV בדגימות קרם מנבדקי קרטוקונוס
מסקנות
- שיטה זו מספקת גישה משופרת לניתוח EV מדגימות ביולוגיות קטנות
- הממצאים תומכים באבחון עתידי ויעדים טיפוליים בבריאות העיניים
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Characterizing extracellular vesicles (EVs) from minimal biological fluid volumes addresses a critical bottleneck in non-invasive biomarker discovery and disease monitoring. This workflow enables high-content EV phenotyping from scarce patient samples, supporting translational research and early-stage target validation. The approach enhances predictive confidence for biomarker-driven portfolio decisions in ocular and systemic disease pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of EV-based biomarkers for disease-relevant pathway analysis.
- Supports functional target validation by quantifying EV phenotypes from patient-derived fluids.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking EV signatures to physiological states.
Screening & Assay Development
- Prepares validated EV detection systems for downstream screening workflows.
- Delivers quantitative, reproducible EV marker measurements from as little as 1 μL of sample.
- Standardizes assay conditions to minimize sample loss and maximize data quality.
Translational & Preclinical Research
- Aligns non-invasive EV biomarker analysis with disease monitoring strategies.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation using patient-derived fluids.
- Supports risk-adjusted advancement of biomarker-driven therapeutic hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This EV characterization protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early biomarker identification with translational validation in limited-sample contexts.
- Discovery Biology: Provides robust hypothesis testing for EV biomarker relevance in disease states.
- Screening: Offers reproducible, quantitative EV marker readouts for assay development.
- Analytics: Delivers particle count, size, and phenotype data to compare biological conditions.
- Translational Research: Connects non-invasive sample analysis to preclinical biomarker validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable platform for EV analysis across diverse biological fluids.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in EV biomarker discovery and target validation.
- Operational Value: Reduces sample requirements and processing time while enhancing reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for biomarker-driven programs and reduces late-stage risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of non-invasive biomarker assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EV biology and fluorescence-based detection systems.
- Needs access to nanoparticle analyzers and tetraspanin chip technology.
- Demands cross-team standardization for sample handling and data interpretation.
- Adaptable to various biological fluids with protocol optimization.
- Potential limitations include chip oversaturation and signal detection thresholds.
