Name: אפיון שלפוחיות חוץ-תאיות מנוזלים ביולוגיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 7 s
Description: למד שיטה לאפיון שלפוחיות חוץ-תאיות מנוזלים ביולוגיים באמצעות שבב טטרספנין. גלה סמנים לא פולשניים לזיהוי מחלות עיניים ולניטור בריאות הקרנית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<table><tbody><tr><td>ChipWasher 100</td><td>NanoView</td><td>EV-CW100</td><td>מדגר, שוטף, שוטף ומייבש את שבבי הטטרה-ספנין. הדגם הנוכחי אינו זמין עוד. מחיר במועד הרכישה: $9,995.00&nbsp;</td></tr><tr><td>תוכנת ExoView Analyzer</td><td>NanoView</td><td>N/A</td><td>מנתחת את פרטי השבב ומייצרת קבצי אקסל להמשך ניתוח. כבר לא זמין.</td></tr><tr><td>ExoView R100</td><td>NanoView</td><td>EV-R100</td><td>משמש לסריקת שבבי הטטרספנין ב-3 אורכי גל. הדגם הנוכחי אינו זמין עוד. מחיר במועד הרכישה:&nbsp; $110,000.00</td></tr><tr><td>תוכנת סורק ExoView</td><td>NanoView</td><td>N/A</td><td>סורקת את השבבים ב-3 אורכי גל שונים. כבר לא זמין.</td></tr><tr><td>ערכות טטרספנין אנושיות</td><td>Unchained Labs</td><td>EV-TETRA-C</td><td>כוללות 8 שבבי טטרספנין, תמיסת דגירה, תמיסת חסימה, נוגדן CD63, נוגדן CD81, נוגדן CD9, פתרון A, פתרון B, USB וכיסוי צלחת.</td></tr></tbody></table>

אפיון שלפוחיות חוץ-תאיות מנוזלים ביולוגיים

Characterizing Extracellular Vesicles from Biological Fluids

בעת ניתוח הכתמים על השבבים, כוונו לריכוז אופטימלי של EVs על ידי התבוננות ברכבים חשמליים המסומנים פלואורסצנטית בערוצי CD63, CD81 ו-CD9, וערוץ MIgG30,91 אמור להישאר שחור, מכיוון שזהו ערוץ הבקרה כפי שניתן לראות באיור 3A. CD81 יופחת עבור נוזלים ביולוגיים. אם אין פלואורסצנטיות בערוצי CD63, CD81 ו-CD9, יש היעדר EVs (איור 3B). היזהרו לא להרוות יתר על המידה את השבב (איור 3C). זה יקשה על תוכנת הניתוח לחשב את הדיוק של הגודל, ספירת החלקיקים הכוללת והפנוטיפים של ה-EVs. מהנקודות של הריכוז האופטימלי, תוכנת הניתוח תוכל למדוד את הגודל (50-200 ננומטר), ספירת החלקיקים הכוללת וביטוי הטטרה-ספנין של ה-EVs (איור 4) ותיוצא לגיליונות אלקטרוניים בודדים להמשך ניתוח. ניתוח הטטרספנין יכלול את הקולוקליזציה של חלבוני פני השטח על ה-EVs. הקולוקליזציה תיוצג עם "/", לדוגמה, "CD63/CD81". זה לא אומר ש-CD63 ו-CD81 משולבים; זה אומר שגם CD63 וגם CD81 ממוקמים על פני השטח של ה-EV.
תוצאות אלה יספקו תובנה חשובה בין דגימות בריאות וחולות. נוכל לקבוע אם דגימות בריאות או דגימות חולות מייצרות יותר רכבים חשמליים, רכבים חשמליים גדולים או קטנים יותר, ואת הפנוטיפ של הרכבים החשמליים. כל אחד מהמאפיינים הללו או כולם יכולים לשחק תפקיד בביוגנזה של המחלה ו/או בהתקדמותה. עם תוצאות אלה, נוכל לראות אם יש היעדר או עלייה ברמות הטטרספנין, מה שיכול לספק תובנה לגבי תהליכים תאיים והיווצרות EVs.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig1.jpg"> 
איור 1: הסוגים והגדלים של הרכבים החשמליים השונים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig2.jpg"> 
איור 2: סכמטי של האופן שבו שבבי הטטרה-ספנין לוכדים ומזהים רכבים חשמליים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig3.jpg"> 
איור 3: אופטימיזציה של ריכוזי EV. (A) ריכוז אופטימלי של רכבים חשמליים. (B) תוצאה שלילית: אין רכבים חשמליים. (ג) רוויית יתר של רכבים חשמליים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig4.jpg"> 
איור 4: נתונים שנוצרו על ידי מנתח הננו-חלקיקים. (A) גודל קוטר EV נמדד בננומטרים. (B) ספירת החלקיקים הכוללת של EVs. (C) פנוטיפ קו-לוקאלי של EV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>טכניקה</td>
			<td>יתרונות</td>
			<td>מגבלות</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>אולטרה-צנטריפוגה</td>
			<td>טוהר גבוה42,43</td>
			<td>שינויים במורפולוגיה של EV42,44</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>הומוגניות42,45</td>
			<td>דורש נפח גדול42,44,46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>פונקציונליות42,43</td>
			<td>יקר42,43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ציטומטריית זרימה</td>
			<td>הערכת דגימות בנקודות זמן מרובות47</td>
			<td>אות חלש48,49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>נקודות קצה מרובות47,50</td>
			<td>נקבוביות סתומות51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ניתוח EV יחיד בתפוקה גבוהה52,53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>צנטריפוגת שיפוע צפיפות</td>
			<td>הפקת דוגמאות טהורות ביותר54</td>
			<td>עבודה אינטנסיבית55,56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>מגוון דוגמאות55,57</td>
			<td>גוזל זמן55,58 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>אובדן יבול משמעותי54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>משקעים</td>
			<td>פשוט59.60</td>
			<td>זיהום36,44,61</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>מהיר61,62</td>
			<td>לא ספציפי63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>תשואה גבוהה44,59,62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pH ניטרלי36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>סינון</td>
			<td>פשוט64 </td>
			<td>מלכודת אקסוזומים65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>מהיר64</td>
			<td>פגיעה בשלפוחיות גדולות36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>זול64</td>
			<td>עוגת פילטר66,67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>סתימת אקסוזום65</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1: יתרונות ומגבלות של טכניקות בידוד EV. רשימה של הדרכים השונות לבודד רכבים חשמליים, כולל היתרונות והמגבלות שלהם.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>טכניקה</td>
			<td>יתרונות</td>
			<td>מגבלות</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>פיזור אור דינמי</td>
			<td>מדידת חלקיקים בגודל 1 ננומטר עד 6 מיקרומטר78 </td>
			<td>לא מתאים למדידת דגימות אקסוזום מורכבות בטווח מידות גדול79 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>הגבול התחתון הוא 10 ננומטר מתאים למערכות חד-דיספריס79 </td>
			<td>לא מסוגל להבחין בין חלבונים מזוהמים לאקסוזומים79</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM)</td>
			<td>שימו לב למורפולוגיה של אקסוזומים79,80 </td>
			<td>הכנות מדגם מסובכות79 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>התבוננו במבנה הפנימי81 </td>
			<td>לא מסוגל להבחין באקסוזומים על סמך גודל וצורה בגלל אותות פלואורסצנטיים מוגזמים82 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים</td>
			<td>מדידת ריכוז, גודל והתפלגות גודל של אקסוזומים בתחום של 10 ננומטר עד 2 מיקרומטר78 </td>
			<td>לא יכול להבדיל את ה-EVs מצברי חלבון ומזהמים אחרים83 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2"></td>
			<td>הכנה ומדידה מהירה של מדגם78,84</td>
			<td>מכשיר NTA יקר85 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ניתן לשחזר דגימות בצורה מקורית84 </td>
			<td>רגיש לרעידות85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>כתם מערבי (WBs)</td>
			<td>יכול לנתח באופן איכותי וכמותי חלבוני סמן79,86 </td>
			<td>מסובך וגוזל זמן79 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ניתוח אקסוזומים ממצע תרבית תאים79 </td>
			<td>EV מבודדים עשויים להכיל ליפופרוטאינים ומזהמים אחרים86 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">ציטומטריית זרימה</td>
			<td>רגישות גבוהה יותר והדמיה ברזולוציה גבוהה ל</td>
			<td rowspan="2">גוזל זמן ומייגע עם מגבלת זיהוי של 400 ננומטר79,88 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>להבחין בין אקסוזומים מוכתמים לבלימות87 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>נדרש ריכוז דגימה נמוך79 </td>
			<td>אותות אופטיים מעכבים את הדיוק והרזולוציה88 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exoview</td>
			<td>מדוד טטרספנינים (CD9, CD63 ו-CD81) על אקסוזומים89 </td>
			<td>לא מודד גדלי EV גדולים יותר75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>מודד חלבוני מטען EV90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 2: יתרונות ומגבלות של טכניקות אפיון EV.

Extracellular vesicles (EVs) are structures that are produced from cells and participate in intercellular communication by transporting biomolecules from ...

שלפוחיות חוץ-תאיות משמשות כסמנים ביולוגיים של מחלות, המשקפות מצבים פיזיולוגיים. הגישה שלנו מאפשרת חילוץ נתונים עשיר מנפחי דמעות זעירים, ומקדמת את מחקר EV בנוזלים ביולוגיים. אתגרי הניסוי העיקריים כוללים השגת ריכוזי שלפוחית חוץ-תאיים מספיקים מדגימות קטנות, מזעור אובדן דגימה במהלך הבידוד ואופטימיזציה של הניתוח כדי למנוע רוויית יתר של השבב או זיהוי אותות חלש.פרוטוקול זה עוקף את שלבי הבידוד, מפחית את זמן העיבוד, ומאפשר ניתוח שלפוחיות חוץ-תאיות מנפחי דגימה קלים, מה שהופך אותו לאידיאלי עבור דגימות ביולוגיות מוגבלות, כמו קרעים. סמנים ביולוגיים לא פולשניים חיוניים לגילוי מוקדם וניהול של הפרעות בקרנית. סמנים ביולוגיים של שלפוחית חוץ-תאית מאפשרים ניטור מחלות, טיפולים מותאמים אישית, היענות טובה יותר למטופלים ואיכות חיים משופרת.המעבדה שלנו הייתה חלוצה בניתוח שלפוחיות חוץ-תאיות בדגימות דמעות מנבדקי KC, וזיהתה חתימות tEV ייחודיות. זה סולל את הדרך לאבחון עתידי ויעדים טיפוליים ממוקדי EV. כדי להתחיל, הציבו את הדגימות הביולוגיות ושבב טטרספנין בסביבת העבודה.פיפטה 70 מיקרוליטר של דגימות ביולוגיות אנושיות שעורבבו מראש עם תמיסה B של ערכת טטרספנין אנושית על שבב. הנח את הסרט על צלחת שטיפת שבבים כדי למנוע אידוי דגימה. לאחר 16 שעות, הניחו את הצלחת במכונת הכביסה.נעל אותו במקומו וסגור את המכסה. לחץ על האפשרות CW-TETRA v0 במכונת הכביסה. בזמן שטיפת השבבים, הכינו 300 מיקרוליטר של תמיסת חסימה לכל שבב.הוסף 0.6 מיקרוליטר מכל נוגדן לכל שבב לתמיסת החסימה. מערבל את תמיסת החסימה עם קוקטייל הנוגדנים כדי להבטיח ערבוב יסודי. בסיום שטיפת השבבים, הוסף 250 מיקרוליטר של תמיסת החסימה עם קוקטייל הנוגדנים על גבי כל שבב.לאחר מכן סגור את המכסה ולחץ על המשך. כאשר מכונת הכביסה מצייצת, הסר את צלחת שטיפת השבבים. הזיזו את הצ'יפים במעלה הרמפה.הנח את הצלחת בחזרה לתוך מכונת הכביסה, וודא שהיא ננעלת היטב במקומה. סגור את המכסה ולחץ על המשך. כדי להתחיל, הפעל מנתח ננו-חלקיקים.הפעל את תוכנת הסריקה על שולחן העבודה המחובר למנתח הננו-חלקיקים. בחר את תיקיית השבבים כדי לבחור כל שבב טטרה-ספנין ואתר אותו במיקום השבב על הצ'אק. לחץ על שלושת הריבועים מתחת למיקום השבב כדי להפעיל את הקרינה.הריבועים יהפכו לצהובים, כחולים ואדומים. לחץ על מכסה הצ'אק ומשוך אותו כדי להסיר אותו. לאחר מכן אבטח היטב את שבבי הטטרספנין העמוסים בדגימה על הצ'אק.יישר את יתדות מכסה הצ'אק עם החורים ולחץ כלפי מטה. החלק את המכסה כדי לנעול אותו במקומו. לאחר מכן הנח את הצ'אק על הבמה ונעל אותו במקומו.לאחר מכן, לחץ על סרוק שבבים מממשק התוכנה, ולאחר מכן לחץ על אישור. לאחר שה-stage עובר במלואו למכונה, סגור את הדלת. בסיום הסריקה, פתח את הדלת כדי להוציא את ה-stage ולוודא את התוצאות. אם הסריקות הצליחו, השליכו את השבבים.הניחו את סט הצ'יפס הבא על הצ'אק. לחלופין, החזירו את הצ'אק הריק לבמה. צא מהתוכנה וכבה את המכשיר בסיום.רמות פלואורסצנטיות אופטימליות של שלפוחיות חוץ-תאיות נצפו בערוצי CD63, CD81 ו-CD9, בעוד שערוץ הבקרה MIgG נותר שחור, מה שאישר את ספציפיות הבקרה. CD81 הופחת עבור נוזלים ביולוגיים. אין פלואורסצנטיות בתעלות CD63, CD81 ו-CD9 מעיד על היעדר שלפוחיות חוץ-תאיות.רוויית יתר של הקרינה הייתה ניכרת, מה שהקשה על הבחנה בנתונים משמעותיים עקב תיוג מוגזם, במיוחד בערוצי CD63, CD81 ו-CD9.

characterizing-extracellular-vesicles-from-biological-fluids

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שלפוחיות חוץ-תאיות הקיימות בדם הוצעו כסמנים ביולוגיים חדשים למחלות שונות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד של מיקרו-שלפוחיות גדולות שמקורן בקרום פלזמה מדגימות דם היקפיות וניתוחם לאחר מכן על ידי ציטומטריית זרימה קונבנציונלית ו-Western Blotting.

בידוד ואפיון של Microvesicles מן הדם היקפי

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את זרימת העבודה מלאה עבור בידוד מהיר של שלפוחית חוץ-תאי של דם אנושי ואפיון של סמני ספציפיים על-ידי ניתוח מעקב nanoparticle מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית. התוצאות שהוצגו להציג רמה גבוהה של הפארמצבטית, ניתן לכוונן תא תרבות supernatants.

אפיון מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית מהירה של יחיד חוץ-תאית שלפוחית בדם אנושי עם ניתוח מעקב ננו-חלקיק

הפרוטוקול מתאר שיטה ישימה מיועד לשימוש עם תא תרבות supernatants לאתר epitopes משטח על שלפוחית קטנה חוץ-תאית (EV). הוא מנצל immunoprecipitation EV ספציפי באמצעות חרוזים בשילוב עם נוגדנים מזהה אנטיגן פני שטח CD9, CD63, CD81. השיטה ממוטבים לניתוח cytometry במורד הזרם.

זרימה Cytometric ניתוח של שלפוחית חוץ-תאית ממדיה ממוזגים-תא

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי לבודד שלפוחית חוץ-תאית קטנה (EVs) של כל הרקמות, כולל דגימות המוח ואת הגידול. שיטה זו מציעה שיטה לשחזור כדי לחלץ EVs מרקמות מוצק עבור נוסף במורד הזרם ניתוחים.

מיצוי של שלפוחית חוץ-תאית מרקמות כל

הדו ח הנוכחי מדגיש את הדרישות כרונולוגי לחילוץ שלפוחית לפוחית (EV) בידוד מ מיקרוגלייה או דם מקרופאגים. Microglia-EVs נגזר הוערכו כרגולטורים של neurite מוצלח בעוד דם מקרופאג-נגזר EVs נחקרו בשליטה של הפלישה C6 glioma תא ב מבחנה. המטרה היא להבין טוב יותר אלה פונקציות EV כמו מגשרים החיסונית במיקרו סביבות מסוימות.

אפיון של תא החיסון-מסחטות נגזרות ושלפוחיות ולימוד השפעה פונקציונלית על סביבת התא

הפרוטוקול כאן מדגים כי ניתן להפריד כראוי שלפוחיות חוץ-תאיות ממדיה מותנית של תרביות תאים באמצעות כרומטוגרפיה של הרחקת גודל.

כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל להפרדת שלפוחיות חוץ-תאיות ממדיית תרבית תאים מותנית

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לחילוץ שלפוחיות חוץ-תאיות מהדם ההיקפי ומרקמות מוצקות עם פרופיל עוקב של אנטיגנים על פני השטח ומטעני חלבונים.

בידוד וניתוח של שלפוחיות חוץ-תאיות ניתנות למעקב ומתפקדות מהפלזמה והרקמות המוצקות

הדור האחרון של כלי אפיון EV מסוגלים לנתח EV יחיד על פני מספר פרמטרים בו זמנית. ציטומטריה של זרימה ננו מודדת את כל החלקיקים הביולוגיים הגדולים מ-45 ננומטר ללא התוויה ומזהה מאפיינים ספציפיים של תת-אוכלוסיות על ידי מגוון טכניקות תיוג פלואורסצנטיות.

אפיון חלבון טרנס-ממברנה חוץ-תאי יחיד על-ידי ציטומטריה של זרימה ננו

מאמר זה מתאר מתודולוגיה לבידוד, אפיון וכימות של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בפלזמה אנושית (EV) ומציג זרימת עבודה לניתוח נטול-תוויות של פרוטאום EV באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם (LC-MS/MS).

בידוד, אפיון וניתוח פרוטאומי של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בפלזמה לגילוי סמנים ביולוגיים קרדיווסקולריים

פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של מיון שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) המשתחררות על ידי תאי סטרומה מזנכימליים. בפרט, הוא מתמקד בהגדרת המכשיר ובאופטימיזציה של תנאי המיון. המטרה היא למיין שלפוחיות חוץ-תאיות תוך שמירה על המאפיינים שלהן.

הגדרת מיון מוצלח לבידוד שלפוחית חוץ-תאית

למד שיטה לאפיון שלפוחיות חוץ-תאיות מנוזלים ביולוגיים באמצעות שבב טטרספנין. גלה סמנים לא פולשניים לזיהוי מחלות עיניים ולניטור בריאות הקרנית.

אפיון שלפוחיות חוץ-תאיות מנוזלים ביולוגיים

גלה סרטונים נוספים