Name: איתור בלב גרעיני ודליפת DNA בתאי יונקים על ידי אימונופלואורסצנציה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: למדו אימונופלואורסצנציה לזיהוי בליטות גרעיניות ודליפת DNA בתאי HeLa. שיטה זו חושפת את הקשר בין הפרעות למינופתיה לנזקי DNA ומנגנוני תיקון לקויים במחלות הזדקנות מואצת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Navarro, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+ZMPSTE24+%28FACE1%29+mutations+in+patients+affected+with+restrictive+dermopathy+or+related+progeroid+syndromes+and+mutation+update%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">New ZMPSTE24 (FACE1) mutations in patients affected with restrictive dermopathy or related progeroid syndromes and mutation update.</a> Eur J Hum Genet. 22 (8), 1002-1011 (2014).</li>
<li>Dittmer, T. A., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lamin+protein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">The lamin protein family.</a> Genome Biol. 12 (222), 1-16 (2011).</li>
<li>Gruenbaum, Y., Margalit, A., Goldman, R. D., Shumaker, D. K., Wilson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+lamina+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The nuclear lamina comes of age.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6, 21-31 (2005).</li>
<li>Navarro, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamin+A+and+ZMPSTE24+%28FACE-1%29+defects+cause+nuclear+disorganization+and+identify+restrictive+dermopathy+as+a+lethal+neonatal+laminopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Lamin A and ZMPSTE24 (FACE-1) defects cause nuclear disorganization and identify restrictive dermopathy as a lethal neonatal laminopathy.</a> Hum Mol Genet. 13 (20), 2493-2503 (2004).</li>
<li>Barrowman, J., Wiley, P. A., Hudon-Miller, S. E., Hrycyna, C. A., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ZMPSTE24+disease+mutations%3A+Residual+proteolytic+activity+correlates+with+disease+severity%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Human ZMPSTE24 disease mutations: Residual proteolytic activity correlates with disease severity.</a> Hum Mol Genet. 21 (18), 4084-4093 (2012).</li>
<li>Richards, S., Muter, J., Ritchie, P., Lattanzi, G., Hutchison, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+accumulation+of+un-repairable+DNA+damage+in+laminopathy+progeria+fibroblasts+is+caused+by+ROS+generation+and+is+prevented+by+treatment+with+N-acetyl+cysteine%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The accumulation of un-repairable DNA damage in laminopathy progeria fibroblasts is caused by ROS generation and is prevented by treatment with N-acetyl cysteine.</a> Hum Mol Genet. 20 (20), 3997-4004 (2011).</li>
<li>Davies, B. S., Fong, L. G., Yang, S. H., Coffinier, C., Young, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+post-translational+processing+of+prelamin+A+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">The post-translational processing of prelamin A and disease.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 10, 153-174 (2009).</li>
<li>Barrowman, J., Hamblet, C., George, C. M., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+prelamin+A+biogenesis+reveals+the+nucleus+to+be+a+CaaX+processing+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Analysis of prelamin A biogenesis reveals the nucleus to be a CaaX processing compartment.</a> Mol Biol Cell. 19, 5398-5408 (2008).</li>
<li>Young, S., Meta, M., Yang, S. H., Fong, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prelamin+A+farnesylation+and+progeroid+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Prelamin A farnesylation and progeroid syndromes.</a> J Biol Chem. 281 (52), 39741-39745 (2006).</li>
<li>Houthaeve, G., Robijns, J., Braeckmans, K., De Vos, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bypassing+border+control%3A+Nuclear+envelope+rupture+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol%22%5BJournal%5D)">Bypassing border control: Nuclear envelope rupture in disease.</a> Physiol. 33 (1), 39-49 (2017).</li>
<li>Schreiber, K. H., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+lamins+go+bad%3A+Nuclear+structure+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">When lamins go bad: Nuclear structure and disease.</a> Cell. 152 (6), 1365-1375 (2013).</li>
<li>Fong, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterozygosity+for+Lmna+deficiency+eliminates+the+progeria-like+phenotypes+in+Zmpste24-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Heterozygosity for Lmna deficiency eliminates the progeria-like phenotypes in Zmpste24-deficient mice.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (52), 18111-18116 (2004).</li>
<li>Pendas, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+prelamin+A+processing+and+muscular+and+adipocyte+alterations+in+Zmpste24+metalloproteinase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Defective prelamin A processing and muscular and adipocyte alterations in Zmpste24 metalloproteinase-deficient mice.</a> Nat Genet. 31, 94-99 (2002).</li>
<li>Goldman, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+mutant+lamin+A+causes+progressive+changes+in+nuclear+architecture+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Accumulation of mutant lamin A causes progressive changes in nuclear architecture in Hutchinson-Gilford progeria syndrome.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101, 8963-8968 (2004).</li>
<li>Eriksson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+de+novo+point+mutations+in+lamin+A+cause+Hutchinson%E2%80%93Gilford+progeria+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recurrent de novo point mutations in lamin A cause Hutchinson–Gilford progeria syndrome.</a> Nature. 423, 293-298 (2003).</li>
<li>Young, S. G., Fong, L. G., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+review+series%3A+Lipid+post-translational+modifications.+Prelamin+A%2C+Zmpste24%2C+misshapen+cell+nuclei%2C+and+progeria%E2%80%94new+evidence+suggesting+that+protein+farnesylation+could+be+important+for+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Thematic review series: Lipid post-translational modifications. Prelamin A, Zmpste24, misshapen cell nuclei, and progeria—new evidence suggesting that protein farnesylation could be important for disease pathogenesis.</a> J Lipid Res. 46 (12), 2531-2558 (2005).</li>
<li>Worman, H. J., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prelamin+A+and+ZMPSTE24+in+premature+and+physiological+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Prelamin A and ZMPSTE24 in premature and physiological aging.</a> Nucleus. 14 (1), 1-17 (2023).</li>
<li>Pande, S., Ghosh, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+proteostasis+imbalance+in+laminopathy-associated+premature+aging+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Nuclear proteostasis imbalance in laminopathy-associated premature aging diseases.</a> FASEB J. 37 (8), 1025-1035 (2023).</li>
<li>Odell, I. D., Cook, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence techniques.</a> J Invest Dermatol. 133 (4), 1-12 (2013).</li>
<li>Kumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+and+enzyme+immunomicroscopy+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunoassay+Immunochem%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence and enzyme immunomicroscopy methods.</a> J Immunoassay Immunochem. 21 (2-3), 235-253 (2000).</li>
<li>Tjaden, A., Giessmann, R. T., Knapp, S., Schroder, M., Muller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+live-cell+multiplex+screen+for+chemogenomic+compound+annotation+based+on+nuclear+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-content live-cell multiplex screen for chemogenomic compound annotation based on nuclear morphology.</a> STAR Protoc. 3 (101791), 1-15 (2022).</li>
<li>Gunn, A. L., Yashchenko, A. I., Dubrulle, J., Johnson, J., Hatch, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-content+screen+reveals+new+regulators+of+nuclear+membrane+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A high-content screen reveals new regulators of nuclear membrane stability.</a> Sci Rep. 14, 6013(2024).</li>
<li>Yu, L., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+DNA+sensing+by+cGAS%3A+Regulation%2C+function%2C+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytosolic DNA sensing by cGAS: Regulation, function, and human diseases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (170), 1-14 (2021).</li>
<li>Odinammadu, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+farnesyl+transferase+inhibitor+%28FTI%29+lonafarnib+improves+nuclear+morphology+in+ZMPSTE24-deficient+fibroblasts+from+patients+with+the+progeroid+disorder+MAD-B%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">The farnesyl transferase inhibitor (FTI) lonafarnib improves nuclear morphology in ZMPSTE24-deficient fibroblasts from patients with the progeroid disorder MAD-B.</a> Nucleus. 14 (1), 1-14 (2023).</li>
</ol>

הלמינה הגרעינית היא רשת של חוטים העומדת בבסיס הממברנה הגרעינית ומורכבת מחלבונים הנקראים למין. הלמינה הגרעינית ממלאת תפקידים חיוניים בארכיטקטורה גרעינית, מיקום נקבוביות גרעיניות, ויסות ביטוי גנים, ארגון כרומטין, שכפול DNA ותיקון DNA 1,2,3. מוטציות בגנים הממלאים תפקיד בביטוי חלבוני הלמין מובילות להפרעות גנטיות הנקראות למינופתיות3.
דרמופתיה מגבילה (RD) היא הפרעת למינופתיה חמורה הנגרמת בעיקר על ידי מוטציות הטרוזיגוטיות מורכבות היוצרות קודוני סיום מוקדמים בגןZMPSTE24 4, מה שמוביל להיעדר ZMPSTE24 המטאלופרוטיז. למינופתיה זו מאופיינת בפיגור בצמיחה תוך רחמית, עור מתוח ונוקשה, פה קטן, שיער דק ופגמים במינרליזציה של העצם1. חולי RD בדרך כלל אינם חיים מעבר לשבוע הראשון לחייהם עקב אי ספיקת ריאות1. שתי הפרעות למינופתיה אחרות הידועות כתסמונת האצ'ינסון-גילפורד פרוגריה לא טיפוסית (AT-HGPS) ודיספלזיה מנדיבולואקרלית מסוג B (MAD-B) כרוכות בביטוי ZMPSTE24 מופחת וקשורות לירידה בתוחלת החיים ומראות דמיון להפרעות הזדקנות מוקדמות5. ZMPSTE24 הפרוטאז המושפע מהלמינופתיות הללו חיוני בשינוי שלאחר התרגום של למין A, שהוא מרכיב קריטי בלמינה הגרעינית. מחסור ZMPSTE24 גורם להצטברות של צורה לא מעובדת של פרנזיל של למין A, הידועה בשם פרלמיןA 2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67719/67719fig1.jpg"> 
איור 1: עיבוד למין A בנורמלי לעומת תאי RD. מסלול עיבוד למין A בתאים נורמליים (משמאל) ועיבוד למין A שונה ב-RD, או תאים חסרי ZMPSTE (מימין). קבוצות Farnesyl (Fa) ו-methyl (Me) מסומנות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67719/67719fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
כפי שניתן לראות באיור 1, בעיבוד רגיל של למין A, קבוצת פרנזיל (שומנים) מחוברת לשאריות ציסטאין ליד מסוף C, ואחריה מחשוף פרוטאוליטי של שלוש חומצות אמינו C-terminal 3,6. לאחר מכן שאריות הציסטאין עוברות מתילציה. שני שינויים אלה מאפשרים למקד פרלמין A לממברנה הגרעינית הפנימית2. לאחר מכן ZMPSTE24 מבצע תגובת מחשוף לפיה 15 חומצות האמינו האחרונות C-terminal, יחד עם קבוצות הפארנזיל והמתיל, מוסרות כדי לייצר חלבון Lamin A בוגר, המועבר ללמינה הגרעינית 6,7,8. ב-RD, AT-HGPS ו-MAD-B, השלב האחרון של העיבוד אינו מתרחש ביעילות מכיוון שהמטאלופרוטאינאז ZMPSTE24 חסר או אינו מתפקד במלואו 8,9. התוצאה היא הצטברות של פרלמין A, שנשאר פרנזילציה ומתיליציה לצמיתות9. הקבוצות האחרונות האלה גורמות לפרלמין A להיצמד לממברנה הגרעינית הפנימית במקום להתמקם בלמינה הגרעינית, שם למין A בוגר אמור לשכון בסופו של דבר, כפי שניתן לראות באיור 1. לפיכך, למחסור ב-ZMPSTE יש השפעות עמוקות על מגוון פונקציות גרעיניות, יחד עם המבנה הגרעיני 10,11,12,13,14,15. שינויים אלה במבנה הגרעיני עשויים לכלול חבטות גרעיניות ואפילו קרע גרעיני שעלול לגרום לדליפת DNA לתוך הציטוזול וכן לחדירת ציטוזול לגרעין. גרעינים בעלי צורה חריגה הם אכן סימן היכר של הפרעות למינופתיה, יחד עם פנוטיפים רבים אחרים הנגרמים על ידי עיבוד פרלמין A פגום16,17. פגמים בלמינה הגרעינית מובילים למספר רב של השפעות מזיקות, כולל מיקום שגוי של בקרת איכות חלבון גרעיני וחלבוני תיקון DNA בנוקלאופלזמה, אשר, בתורו, גורם לפגמים רבים בתפקוד הגרעיני18. חשוב שתהיה טכניקה פשוטה שיכולה לעזור לזהות ולנטר את סימני ההיכר הללו של למינופתיה כדי להקל על המחקר בפיתוח גישות טיפוליות שמטרתן לשפר את הפנוטיפים של הלמינופתיה. עבור עכברים עם למינופתיה, הוכח כי חיסול הבלבל הגרעיני נמצא בקורלציה עם חיסול כללי של פנוטיפים של למינופתיה16. טכניקה המאפשרת ניטור שלמות גרעינית בתאים אנושיים יכולה לשפר את המחקר של טיפולים פוטנציאליים לחיסול או שיפור משמעותי של פנוטיפים של מחלות.
אימונופלואורסצנציה עקיפה (IF) היא טכניקה רגישה ונמצאת בשימוש נרחב המשתמשת הן בנוגדנים ראשוניים ללא תווית והן בנוגדנים משניים המסומנים בפלואורופור המזהה את הנוגדן העיקרי כדי לזהות מטרה מעניינת19. שיטות IF יכולות לספק אמצעי רב עוצמה להמחשת רכיבים ומבנים תוך-תאיים ספציפיים. ייתכן גם שיותר ממולקולת נוגדן משנית אחת עשויה לקיים אינטראקציה עם הנוגדן הראשוני, וכתוצאה מכך להגביר את האות19. IF עקיף היא טכניקה רב-תכליתית המאפשרת גם זיהוי של נוגדנים ראשוניים מרובים עם קבוצה קטנה יחסית של נוגדנים משניים מכיוון שנוגדנים משניים מועלים כנגד תחום ה-Fc של הנוגדן הראשוני, השמור בתוך מין19.
מאמר זה מתאר שיטה עקיפה (IF) להערכת דליפה גרעינית ודליפת DNA בתאים עם מחסור ZMPSTE24, תוך שימוש בנוגדנים כנגד DNA דו-גדילי (dsDNA) ולמין B1 כדי לזהות DNA והלמינה הגרעינית, בהתאמה. כדי להדגים את התועלת של גישה זו, ההליך יושם על קו תאי HeLa עם ביטוי ZMPSTE24, כמו גם קו תאי HeLa המבטא ZMPSTE24, והתוצאות עבור שני קווי התאים הושוו.

<table><tbody><tr><td>22 מ"מ כיסויי זכוכית מרובעים</td><td>Propper Manufacturing Company</td><td>M8710</td><td>ניתן להשתמש בכל גודל או צורה כל עוד ניתן לקבע אותם לשקופית מיקרוסקופ רגילה.&nbsp;</td></tr><tr><td>36.5% פורמלדהיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>F8775</td><td>ריאגנט קיבוע.&nbsp;</td></tr><tr><td>75 ס"מ 2 צלוחיות</td><td>קורנינג</td><td>430725U</td><td>לתרבית תאים.&nbsp;</td></tr><tr><td>סרום בקר לבינום (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>9048-46-8</td><td>מאגר דילול נוגדנים.&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM עם 1 גרם/ליטר גלוקוז, L-גלוטמין ונתרן פירובט</td><td>קורנינג</td><td>10-014-CV</td><td>לתרבית תאים.&nbsp;</td></tr><tr><td>אתנול (200 הוכחה)</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td>לייבוש דגימות לפני ההרכבה, מדולל ליצירת ריכוזים מרובים.&nbsp;</td></tr><tr><td>EVOS FL מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך</td><td>דיגיטלי פישר סיינטיפיק</td><td>12-563-460</td><td>הדמיה.&nbsp;</td></tr><tr><td>ג'לטין דגים</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7041</td><td>מאגר דילול נוגדנים.&nbsp;</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>אמצעי הרכבה למניעת פוטוהלבנה.&nbsp;</td></tr><tr><td>פרפילם (4 אינץ')</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-374-12</td><td>ניתן להחליף כל גודל, כל עוד הכיסויים שבהם נעשה שימוש יכולים להתאים.&nbsp;</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>גיבקו</td><td>15-140-122</td><td>לתרבית תאים.&nbsp;</td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>מיוצר ומעוקר במעבדה לתרבית רקמות ותמיסות.</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי פרימיום (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>לתרבית תאים.&nbsp;</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ פרימיום סופרפרוסט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-544-7</td><td>ניתן להשתמש בכל שקופיות מיקרוסקופ סטנדרטיות.&nbsp;</td></tr><tr><td>תרבית רקמות מטופלת 6 בארות צלחות תחתונות שטוחות</td><td>פלקון</td><td>353046</td><td>לתרבית תאים.&nbsp;</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A16046. AP</td><td>לכביסה.</td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.5%)</td><td>גיבקו</td><td>15-400-054</td><td>לתרבית תאים.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>9005-64-5</td><td>מגיב חדירת תאים.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

איתור בלב גרעיני ודליפת dna בתאי יונקים על ידי אימונופלואורסצנציה

Detection of Nuclear Blebbing and DNA Leakage in Mammalian Cells by Immunofluorescence

מחקר זה מציג שיטת IF להדמיית הלמינה הגרעינית בשילוב עם DNA דו-גדילי (dsDNA). לאחר ביצוע IF, ניתן לבדוק את התמונות שצולמו לאיתור סימנים של בלבל גרעיני ודליפת DNA.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67719/67719fig2.jpg"> 
איור 2: בלבל גרעיני בתאי HeLa CT ו-ZMPSTE24 KO. תמונות מייצגות של שני קווי התאים המשמשות לקביע...

איתור בלב גרעיני ודליפת DNA בתאי יונקים על ידי אימונופלואורסצנציה

The nuclear lamina is a network of filaments underlying the nuclear membrane, composed of lamins and lamin-associated proteins. It plays critical roles in ...

detection-nuclear-blebbing-dna-leakage-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה של ​​מולקולות דנ"א בודדות התבוננות בתאים חיים מתוארת. הטכניקה מתבססת על הכריכה של חלבון מתויג fluorescently lac repressor לאתרי קישור מהונדס לתוך הדנ"א של עניין. שיטה זו יכולה להיות מותאמת למעקב DNAs רקומביננטי רב בתאי חיים לאורך זמן.

ניטור כפול פלסמיד בתאי יונקים חיים דרך מספר דורות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי

בסרטון זה, אנו מתארים את שיטת האימונופלואורסנציה כדי לדמיין את הלוקליזציה של חלבוני תיקון הדנ"א γH2AX ו- 53BP1 באתרים של הפסקות DNA דו-גדילי בגרעין התא המוקרנ.

הדמיה מבוססת אימונופלואורסנציה של אינטראקציות חלבון תיקון DNA

בסרטון זה, אנו מתארים את טכניקת המיקרוסקופ האימונופלואורסצנטי כדי לזהות חלבונים ספציפיים של תגובת נזק לדנ"א הממוקמים באתרים של שברים דו-גדיליים בדנ"א בתאים חד-גרעיניים אנושיים. החלבונים מזוהים על ידי נוגדנים ראשוניים ספציפיים, אשר בתורם נקשרים לנוגדנים משניים המתויגים בפלואורופור הפולטים פלואורסצנט במהלך הדמיה מיקרוסקופית, ומאפשרים הדמיה של החלבונים כמוקדים פלואורסצנטיים נפרדים בתוך גרעיני התא.

מיקרוסקופ אימונופלואורסנציה לניתוח שברים דו-גדיליים של DNA

כתב יד זה מתאר טכניקה חדשה המאפשרת זיהוי ביטוי גנים תוך תאי לאחר אנדוציטוזיס של ננו-חלקיקים המסומנים בפלואורסצנטיות ישירות בתאים חיים. השיטה אינה דורשת מניפולציה של התאים ואינה מוגבלת ביחס לגן או למין המטרה.

זיהוי של ביטוי גנים בתאים תאיים חיים של Murine, אדם וחזירי מקור באמצעות חלקיקים שכותרתו פלואורסצנטי

הנה, הוא הוכיח כיצד באתרו Proximity Ligation Assay (PLA) ניתן להשתמש כדי לזהות ולחזות אינטראקציות חלבונים ישיר חלבון בין כספומט p53 בתרביות תאים ההשעיה חשופים ללחץ genotoxic.

איתור ויזואליזציה של DNA הנזק- Induced חלבון קומפלקסים ההשעיה תא תרבויות באמצעות Assay קשירת הקרבה

Microirradiation לייזר הוא כלי שימושי עבור מחקרים של תיקון ה-DNA בתאים חיים. בגישה מתודולוגי לשימוש של לייזרים UVA לזירוז נגעים דנ א שונים מוצג. לנו יש אופטימיזציה שיטה microirradiation המקומי המתחזק מחזור תא נורמלי; לפיכך, תאים לקרינה להמשיך לעבור מיטוזה.

מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות ללמוד אינטראקציות חלבון-חלבון וקינטיקה ב DNA נגעים מתקדמות

קרינה פלואורסצנטית קונאפוקלית מיקרוסקופ לייזר מיקרו-הקרנה הצעה וכלים גרימת נזק לדנ א וניטור התגובה של חלבונים תיקון ה-DNA באזורים נבחרים גרעיני תת. טכניקה זו התקדמה באופן משמעותי את הידע שלנו של גילוי הנזק, איתות, גיוס. כתב יד זה מדגים הטכנולוגיות הללו לבחון סטרנד ליחיד מעבר לתיקון.

היישום של לייזר מיקרו-הקרנה בחינת יחיד ותיקון כפול Strand Break בתאים בתרבית

הדמיה לחיות תאים מספק שפע של מידע על תאים בודדים או באוכלוסיות שלמות כי הוא בלתי ניתן להשגה על-ידי תא קבוע הדמיה לבד. כאן, מתוארים פרוטוקולי הדמיה לחיות תאים כדי להעריך את החלטות גורל התא לאחר הטיפול עם פקליטקסל סמים אנטי mitotic.

לטווח ארוך לחיות תאים הדמיה כדי להעריך את גורל בתגובה פקליטקסל

תיקון של זוגיות-גדיל DNA מעברי הוא תהליך דינמי, הדורשים לא רק היווצרות תיקון מכלולי השברים, אבל גם הרזולוציה שלהן לאחר הנגע הוא ממוען. כאן, אנו משתמשים מיקרוסקופ immunofluorescence עבור ארעי לטווח ארוך כפול גדילי ומעברי ככלי לנתח מנגנון תחזוקה זה הגנום.

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

המושרה קרינה נזק DNA תגובה המופעלת על ידי מעורב נייטרון קרן המשמש בטיפול בורון נייטרון לכידת (BNCT) לא הוקמה במלואה. פרוטוקול זה מספק הליך צעד אחר צעד כדי לזהות וקדי המושרה קרינה (רי ' ף) של תיקון חלבונים על ידי immunofluorescence כתמים של סרטן המעי הגס האנושי התאים לאחר הקרנה עם הקורה מעורב נייטרונים.

Immunofluorescence הדמיה של נזק לדנ א ותיקון Foci בתאי סרטן המעי הגס האנושי

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מדגימים כיצד לדמיין כריתת קצה דו-גדילית של דנ"א במהלך שלב S/G2 של מחזור התא באמצעות שיטה מבוססת אימונופלואורסצנטיות.

הערכה של כריתת קצה כפולת גדילים של DNA גלובלי באמצעות תיוג BrdU-DNA בשילוב עם הדמיית אפליה במחזור התא

למדו אימונופלואורסצנציה לזיהוי בליטות גרעיניות ודליפת DNA בתאי HeLa. שיטה זו חושפת את הקשר בין הפרעות למינופתיה לנזקי DNA ומנגנוני תיקון לקויים במחלות הזדקנות מואצת.

איתור בלב גרעיני ודליפת DNA בתאי יונקים על ידי אימונופלואורסצנציה

גלה סרטונים נוספים