הדמיית אותות Ca²⁺ בוורידי ריאה קטנים בלחצים תוך-לומינליים פיזיולוגיים

בפרוטוקול זה, אנו מציגים טכניקה חדשה לרישום וניתוח אותות Ca²⁺ בוורידים תוך-ריאתיים (ורידים ריאתיים קטנים או PVs) בלחצים תוך-לומינליים פיזיולוגיים. הטכניקה כוללת בידוד PVs קטנים, דגירה שלהם עם מחוון Ca²⁺ , קנולציה ולחץ עליהם, הדמיה קונפוקלית של אותות Ca²⁺ וניתוח נתונים.

אותות סידן מווסתים את תפקוד כלי הדם, משתנים במקורם ובתפקידם. אנו שואפים להבין את התפקודים הספציפיים שלהם בדופן כלי הדם ולזהות חריגות הקשורות למחלות. רוב מחקרי כלי הדם של הריאות מתמקדים בעורקים או בנימים, ולא בוורידים ריאתיים.

אף מחקר לא בדק אותות סידן בוורידי ריאה בלחצים תוך-לומינליים רגילים למרות הרלוונטיות הפיזיולוגית שלהם. ורידים ריאתיים עוברים שינוי לחץ במהלך מחזורי הלב, אך השפעתם על אותות הסידן לא נחקרה. הפרוטוקול שלנו מאפשר רכישה וניתוח אוטומטי של אותות סידן בוורידי ריאה קטנים בלחץ רגיל.

הפרוטוקול שלנו מאפשר מחקרים עתידיים על האופן שבו לחץ תוך-לומינלי משפיע על אותות סידן בוורידי ריאה קטנים, ומקדם את ההבנה של ויסות ותפקידם בבריאות ובמחלות. כדי להתחיל, יש לנקות את כלי החיתוך והכלים באתנול 100%, ולאחר מכן לשטוף אותם במים נטולי יונים. עם מספריים.

פתח את חלל בית החזה של עכבר שעבר המתת חסד. השתמש במלקחיים כדי להסיר בזהירות את הלב והריאות מחלל בית החזה עם נגיעה מינימלית בריאות. לאחר מכן, הניחו את הטישו על צלחת מצופה מגן איטום המכילה תמיסת מלח פיזיולוגית קרה.

הצמד את הלב והריאות באמצעות סיכות דיסקציה כך שוורידי הריאה הגדולים ועורקי הריאה נראים בבירור, והאונה השמאלית של הריאה נמתחת מעט. בעזרת ורידי הריאה הגדולים כנקודות התייחסות, הסר בזהירות את הרקמה המקיפה את הוורידים הבין ריאתיים הקטנים בעזרת מספריים עדינים. לאחר מכן בודד בעדינות את ורידי הריאה הקטנים מהרקמה שמסביב.

לאחר מכן, הכינו ריכוז מלאי של 2.5 מילי-מולרי Fluo-4 AM עם DMSO. בעזרת תמיסת המלאי, הכינו את תמיסת הטעינה. הניחו את ורידי הריאה הקטנים בצינור של 1.5 מיליליטר עם תמיסת הטעינה.

מכסים את הצינור בנייר אלומיניום, מודגר באמבט מים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. כדי לשרוף את ורידי הריאה הקטנים, הסר וריד מתמיסת הכביסה. הנח אותו בתא מיוגרפיה בלחץ מוכן.

בעזרת זוג מלקחיים דקים, קנו בזהירות קצה אחד של וריד הריאה הקטן על אחת הצינוריות, ולאחר מכן השתמשו במיקרופילמנט חוט ניילון כדי לקשור קשר סביב הקצה הקנולטורי של וריד הריאה הקטן וקצה הצינורית כדי לאבטח אותו. דחוף את תמיסת המלח הפיזיולוגית בעדינות דרך הצינורית כדי להסיר את הדם בתוך וריד הריאה. השתמש בחוט ניילון כדי לקשור את הקצה השני עם צינורית זכוכית באמצעות מיקרו חוטים.

להדמיית סידן, חבר תחילה בקר לחץ סרוו לצינור המכיל תמיסת מלח פיזיולוגית חוצצת HEPES. השתמש בבקר כדי להפעיל לחץ על וריד הריאה הקטן מקצה אחד. כעת חבר משאבה פריסטלטית לכניסה ולשקע ולשקע ומזג את התמיסה.

לאחר תקופת שיווי המשקל, השתמש במטרת טבילת המים פי 40 ובמערכת הדמיה קונפוקלית של דיסק מסתובב כדי לרכוש תמונות סידן עבור 1,000 פריימים. כדי לבצע ניתוח תמונה, הפעל את Spark והתוכנה המעוצבים בהתאמה אישית. השתמש במסנן חמש על חמש ובמסנן החציוני כדי להחליק את התמונות, ולאחר מכן מסגרת המתארת אזור שטוח של וריד הריאה עם תאים מרובים לזיהוי אוטומטי של אירועים.

לחץ על תצוגה וזיהוי אוטומטי של אירועים. הגדר את סף האירועים במשרעת של 1.3F מעל F0, את הסובלנות ל-20%תיבת הסריקה לשבע על שבעה פיקסלים, ואת הממוצע הריצה לשבע תמונות. לחץ על התחל חיפוש או על סמל העין.

מצא את טבלת האירועים על ידי לחיצה על טבלת האירועים הקטנים בתפריט התצוגה, ולאחר מכן חשב את האירועים למיקרומטר ריבוע על ידי חלוקת מספר אותות יוני הסידן שזוהו בשטח המסגרת שנבחרה. מספר אותות הסידן המתרחשים באופן ספונטני בוורידי ריאה קטנים בחמישה מילימטרים של לחץ כספית תוך-לומינלי היה 0.73 פלוס או מינוס 0.2 אירועים לדקה למיקרומטר רבוע בתנאים בסיסיים. תוספת ריאנודין הפחיתה באופן דרסטי את פעילות איתות הסידן.