הדמיית אותות Ca2+ בוורידי ריאה קטנים בלחצים תוך-לומינליים פיזיולוגיים
21 במרץ 2025
בפרוטוקול זה, אנו מציגים טכניקה חדשה לרישום וניתוח אותות Ca2+ בוורידים תוך-ריאתיים (ורידים ריאתיים קטנים או PVs) בלחצים תוך-לומינליים פיזיולוגיים. הטכניקה כוללת בידוד PVs קטנים, דגירה שלהם עם מחוון Ca2+ , קנולציה ולחץ עליהם, הדמיה קונפוקלית של אותות Ca2+ וניתוח נתונים.
אותות סידן מווסתים את תפקוד כלי הדם, משתנים במקורם ובתפקידם. אנו שואפים להבין את התפקודים הספציפיים שלהם בדופן כלי הדם ולזהות חריגות הקשורות למחלות. רוב מחקרי כלי הדם של הריאות מתמקדים בעורקים או בנימים, ולא בוורידים ריאתיים.
אף מחקר לא בדק אותות סידן בוורידי ריאה בלחצים תוך-לומינליים רגילים למרות הרלוונטיות הפיזיולוגית שלהם. ורידים ריאתיים עוברים שינוי לחץ במהלך מחזורי הלב, אך השפעתם על אותות הסידן לא נחקרה. הפרוטוקול שלנו מאפשר רכישה וניתוח אוטומטי של אותות סידן בוורידי ריאה קטנים בלחץ רגיל.
הפרוטוקול שלנו מאפשר מחקרים עתידיים על האופן שבו לחץ תוך-לומינלי משפיע על אותות סידן בוורידי ריאה קטנים, ומקדם את ההבנה של ויסות ותפקידם בבריאות ובמחלות. כדי להתחיל, יש לנקות את כלי החיתוך והכלים באתנול 100%, ולאחר מכן לשטוף אותם במים נטולי יונים. עם מספריים.
פתח את חלל בית החזה של עכבר שעבר המתת חסד. השתמש במלקחיים כדי להסיר בזהירות את הלב והריאות מחלל בית החזה עם נגיעה מינימלית בריאות. לאחר מכן, הניחו את הטישו על צלחת מצופה מגן איטום המכילה תמיסת מלח פיזיולוגית קרה.
הצמד את הלב והריאות באמצעות סיכות דיסקציה כך שוורידי הריאה הגדולים ועורקי הריאה נראים בבירור, והאונה השמאלית של הריאה נמתחת מעט. בעזרת ורידי הריאה הגדולים כנקודות התייחסות, הסר בזהירות את הרקמה המקיפה את הוורידים הבין ריאתיים הקטנים בעזרת מספריים עדינים. לאחר מכן בודד בעדינות את ורידי הריאה הקטנים מהרקמה שמסביב.
לאחר מכן, הכינו ריכוז מלאי של 2.5 מילי-מולרי Fluo-4 AM עם DMSO. בעזרת תמיסת המלאי, הכינו את תמיסת הטעינה. הניחו את ורידי הריאה הקטנים בצינור של 1.5 מיליליטר עם תמיסת הטעינה.
מכסים את הצינור בנייר אלומיניום, מודגר באמבט מים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. כדי לשרוף את ורידי הריאה הקטנים, הסר וריד מתמיסת הכביסה. הנח אותו בתא מיוגרפיה בלחץ מוכן.
בעזרת זוג מלקחיים דקים, קנו בזהירות קצה אחד של וריד הריאה הקטן על אחת הצינוריות, ולאחר מכן השתמשו במיקרופילמנט חוט ניילון כדי לקשור קשר סביב הקצה הקנולטורי של וריד הריאה הקטן וקצה הצינורית כדי לאבטח אותו. דחוף את תמיסת המלח הפיזיולוגית בעדינות דרך הצינורית כדי להסיר את הדם בתוך וריד הריאה. השתמש בחוט ניילון כדי לקשור את הקצה השני עם צינורית זכוכית באמצעות מיקרו חוטים.
להדמיית סידן, חבר תחילה בקר לחץ סרוו לצינור המכיל תמיסת מלח פיזיולוגית חוצצת HEPES. השתמש בבקר כדי להפעיל לחץ על וריד הריאה הקטן מקצה אחד. כעת חבר משאבה פריסטלטית לכניסה ולשקע ולשקע ומזג את התמיסה.
לאחר תקופת שיווי המשקל, השתמש במטרת טבילת המים פי 40 ובמערכת הדמיה קונפוקלית של דיסק מסתובב כדי לרכוש תמונות סידן עבור 1,000 פריימים. כדי לבצע ניתוח תמונה, הפעל את Spark והתוכנה המעוצבים בהתאמה אישית. השתמש במסנן חמש על חמש ובמסנן החציוני כדי להחליק את התמונות, ולאחר מכן מסגרת המתארת אזור שטוח של וריד הריאה עם תאים מרובים לזיהוי אוטומטי של אירועים.
לחץ על תצוגה וזיהוי אוטומטי של אירועים. הגדר את סף האירועים במשרעת של 1.3F מעל F0, את הסובלנות ל-20%תיבת הסריקה לשבע על שבעה פיקסלים, ואת הממוצע הריצה לשבע תמונות. לחץ על התחל חיפוש או על סמל העין.
מצא את טבלת האירועים על ידי לחיצה על טבלת האירועים הקטנים בתפריט התצוגה, ולאחר מכן חשב את האירועים למיקרומטר ריבוע על ידי חלוקת מספר אותות יוני הסידן שזוהו בשטח המסגרת שנבחרה. מספר אותות הסידן המתרחשים באופן ספונטני בוורידי ריאה קטנים בחמישה מילימטרים של לחץ כספית תוך-לומינלי היה 0.73 פלוס או מינוס 0.2 אירועים לדקה למיקרומטר רבוע בתנאים בסיסיים. תוספת ריאנודין הפחיתה באופן דרסטי את פעילות איתות הסידן.
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את התפקודים הספציפיים של אותות סידן (Ca2+) בוורידים ריאתיים (PVs) קטנים תחת לחצים תוך-לומנליים פיזיולוגיים, תחום שטרם נחקר בעבר במחקרים על כלי דם בריאות. המחברים מציגים פרוטוקול חדש לבידוד PVs קטנים, יישום של אינדיקטורים ל-Ca2+, וביצוע הדמיה קונפוקלית לניתוח אותות אלה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- פיזיולוגיה של מערכת הלב וכלי הדם
- איתות סידן
- ביולוגיה של כלי הדם
רקע
- אותיות סידן הן קריטיות לתפקוד כלי דם.
- חקירה של PVs היא חיונית כיוון שהם משפיעים על זרימת הדם הריאתית.
- לא נערכו מחקרים קודמים שהעריכו אותיות Ca2+ ב-PVs תחת לחצים נורמליים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד של PVs קטנים מריאות עכבר
- שימוש ב-Fluo-4 AM לדימות סידן
- מיקרוסקופיה קונפוקאלית לזיהוי וניתוח אותות
תוצאות עיקריות
- ביסוס פרוטוקול לניתוח איתות Ca2+ ב-PVs קטנים.
- תדירות איתות Ca2+ בקו הבסיס שנמדדה הייתה 0.73 ± 0.2 אירועים לדקה למסמילימטר רבוע.
- טיפול בריאנודין הפחית באופן משמעותי את פעילות איתות ה-Ca2+.
מסקנות
- המחקר מקדם את ההבנה כיצד לחץ תוך-לומיני משפיע על אותות Ca2+ בוורידים פולמונריים (PVs) קטנים.
- לממצאים יש השלכות על הבנת הוויסות הווסקולרי במצב בריאותי ובמצב מחלה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימוי כמותי של אותות Ca2+ בוורידים ריאתיים קטנים בלחצים פיזיולוגיים נותן מענה לפער קריטי בביולוגיה של כלי הדם, ומאפשר הפחתת סיכונים מנגנונית לצורך תיקוף של מטרות בכלי הדם הריאתיים. יכולת זו מגבירה את הביטחון החזוי בשלבים מוקדמים של הגילוי, על ידי אספקת קריאות כמותיות וישירות של סיגנלינג וסקולרי תחת תנאים קרובים לפיזיולוגיים. השיטה תומכת בקבלת החלטות לגבי תיקי פיתוח על ידי הבהרת ההשפעה התפקודית של התערבויות מועמדות על נתיבי סיגנלינג וסקולריים הרלוונטיים למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה ישירה של סיגנלינג המתווך על ידי Ca2+ במערכות כלי דם רלוונטיות למחלה.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד ההשפעות של מודולציה של קולטן ריאנודין על תפקוד כלי הדם.
- מספק נקודות קצה כמותיות לתיקוף תפקודי של מטרה במחקר של כלי דם ריאתיים.
סינון ופיתוח בדיקות
- מגדיר תהליך עבודה הניתן לשחזור לצילום ולכימות של אותות Ca2+ ברקמה כלי דם שלמה.
- מסייע בסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות תנאי לחץ מוגדרים וספי סף אוטומטיים לזיהוי אירועים.
- מאפשר השוואה מהימנה של השפעות תרכובות על דינמיקת אותות Ca2+ בכלי הדם.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את התנאים הניסיוניים ללחצים פיזיולוגיים כדי לשפר את הרלוונטיות התרגומית של הממצאים.
- תומכת ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי אספקת מדדים תפקודיים הרלוונטיים למחלה.
- מפחיתה את הסיכון התרגומי על ידי מתן אפשרות לגילוי מוקדם של השפעות כלי דם לא רצויות או השפעות מחוץ למטרה (off-target).
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
פרוטוקול הדמיה זה משתלב ברצף שבין השלב הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי אספקת פלטפורמה לבדיקת השערות, תיקוף מטרות והערכה כמותית של סיגנל сосуכי תחת תנאים פיזיולוגיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקה מונחית-היפותזה של מסלולי איתות של Ca2+ בוורידים ריאתיים.
- סריקה: מספקת פלטיים כמותיים וסטנדרטיים להשוואות בין תנאים שונים ובין תרכובות שונות.
- אנליטיקה: מספקת זיהוי אירועים אוטומטי וכימות תדירות לצורך ניתוח סטטיסטי חסון.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין ממצאים in vitro לרלוונטיות in vivo על ידי שמירה על תנאי לחץ פיזיולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר של דימיון ואנליזה עבור תוכניות מחקר וסקולריות מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות כלי דם.
- ערך תפעולי: מתקנן את תהליכי העבודה של הדימות והניתוח לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס לקבלת החלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) באמצעות אספקת נתונים כמותיים ורלוונטיים פיזיולוגית בשלב מוקדם של התהליך.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות כלי דם והתערבויות מועמדות מתוך התחשבות בסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציה של כלי דם, מיוגרפיה של לחץ ודימוי קונפוקאלי.
- מחייב גישה למיקרוסקופיה קונפוקאלית עם דיסקה מסתובבת (spinning disk) במהירות גבוהה ותוכנה לניתוח אוטומטי.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של הגדרות הלחץ וספי סף לזיהוי אירועים.
- עשוי לדרוש התאמה לגדלי כלי דם או למינים שונים כדי להבטיח רלוונטיות תרגומית.
- מוגבל לניתוח ex vivo; ייתכן שיהיה צורך בתיקוף in vivo כדי להגיע לביטחון תרגומי מלא.
