התמרה רטרו-ויראלית יעילה וביות תחרותי לחקירת לוקליזציה של תאי T בתיווך GPCR במיקרו-סביבות רקמה מגוונות

המחקר שלנו בוחן כיצד GPCRs משפיעים על סחר בתאי חיסון ומיקומם על פני מיקרו-סביבות רקמה שונות. באמצעות פרוטוקול זה ופרוטוקולים משלימים אחרים, המעבדה שלנו זיהתה ציר כימו-אטרקטיבי ספציפי לאיבר ברקמות הריריות שאינן במעי. אז עכשיו, גילינו כיצד לימפוציטים, ביתם של הקיבה, הריאות, קנה הנשימה ומערכת העיכול. אני מציג שיטה יעילה ומשופרת לבדיקת האופן שבו GPCRs בודדים משפיעים על תנועת תאי T in vivo. פיתחנו דרך אמינה להחדיר את הקולטנים הללו לתאי T, המאפשרים כעת השוואה ישירה זה לצד זה במבחני ביות תחרותיים. כעת, כשאנחנו יודעים כיצד GPCRs מנחים תאי T in vivo, חוקרים יכולים לקשר טוב יותר בין ביטוי קולטנים לתפקוד חיסוני. זה יעזור לחוקרים באימונולוגיה בסיסית, כמו גם במחקר טיפולי. בגישה זו, אנו יכולים כעת לשאול כיצד GPCRs פחות מוכרים או לא מאופיינים מעורבים בהנחיית תאי T לרקמות ספציפיות. אנו יכולים ללמוד כיצד ניתן לכוונן את איתות GPCR לטיפול בסרטן או באוטואימוניות. אנו יכולים לעזור לתאי ה-T להגיע למקום הנכון בזמן הנכון לגישות טיפוליות.

[קריין] כדי להתחיל, ביום הראשון, מצפים צלחות תרבית רקמות של 10 סנטימטר בחמישה מיליליטר של 50 מיקרוגרם למיליליטר תמיסת פולי-D-ליזין שהוכנה במים סטריליים. דגרו את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות, ואז שטפו את הצלחות פעמיים עם PBS סטרילי ללא סידן ומגנזיום כדי להבטיח שלא יישארו שאריות. לאחר מכן, נתק תאי Plat-E באמצעות שני מיליליטר של 0.05% טריפסין ו-0.5 מילי-מולרי EDTA ב-37 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. כדי להבטיח את כדאיות התא באמצעות מבחן אי הכללת הטריפן הכחול, מערבבים נפח שווה של תרחיף התא עם תמיסת טריפן כחולה. לאחר מכן, זרעו 3 מיליון תאים חיים בצלחת פטרי של תרבית רקמה בגודל 10 סנטימטר עם מדיום Plat-E ללא אנטיביוטיקה. ביום השני, החלף את המדיום בתרביות תאים Plat-E ב-6.5 מיליליטר של חומר מופחת בסרום. מכינים את תערובת הטרנספקציה לפי הוראות היצרן. עבור כל צלחת, מערבבים 45 מיקרוליטר של Lipofectamine 2000 עם 210 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת בצינור אחד ו-15 מיקרוגרם של DNA עם 235 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת בצינור אחר. שלב את תכולת הצינורות על ידי פיפטינג שלוש עד ארבע פעמים ודגר במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי להקל על היווצרות מורכבת. כעת, מוסיפים את התערובת טיפתית לצלחות ודוגרים למשך 16 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מצפים צלחות של 24 בארות להפעלת תאי T עם CD28 ו-CD3 נגד עכבר ב-375 מיקרוליטר לבאר PBS. דגרו את הצלחות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס או במשך שלוש עד ארבע שעות באינקובטור המוגדר על ארבע מעלות צלזיוס. ביום השלישי, השתמש בבוכנת מזרק כדי לרסק בעדינות את הטחול של העכברים המבודדים על מסננת תאי רשת ניילון בגודל 100 מיקרומטר המונחת בצלחת של שש בארות המכילה מדיום RPMI. העבירו את מתלה התאים דרך מסננת תאי רשת ניילון בגודל 40 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר כדי לקבל מתלה תא בודד. צנטריפוגה את התמיסה ב-450 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו את התאים עם PBS ללא סידן ומגנזיום. לאחר מכן, בצע בחירה שלילית מגנטית באמצעות ערכת הבידוד CD4 של תא ה-T של העכבר בהתאם להוראות היצרן. ספרו את תא ה-T המבודד באמצעות מונה תאים. צלח את תאי ה-T בבארות ההפעלה המצופות של תאי T בצפיפות של 1 עד 1.5 מיליון תאים לבאר במיליליטר אחד של מדיום RPMI 10. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני באינקובטור לח למשך 24 עד 48 שעות. ביום הרביעי, אספו כ-12 מיליליטר של סופרנטנט ויראלי מלוחות 10 סנטימטרים לתוך צינור חרוטי. החלף את המדיום בלוחות התרבית Plat-E ב-10 מיליליטר של מדיום Plat-E נטול אנטיביוטיקה כדי לייצר יותר סופרנטנט ויראלי להתמרה שנייה למחרת. כדי לסנן את הסופרנטנט הנגיפי שנאסף, העבירו אותו דרך מסנן מזרק של 0.45 מיקרומטר. הוסף שמונה מיקרוגרם למיליליטר פוליברן ודילול אחד עד 100 של מאגר HEPES לסופרנטנט המסונן. סובב את צלחת תאי ה- T בת 24 הבארות למשך שבע דקות במשקל של 950 גרם. לאחר מכן, אסוף בזהירות ושמור את הסופרנטנט מבלי לעקור את תאי ה-T. כדי לבצע זיהום, הוסף מיליליטר אחד של סופרנטנט ויראלי לכל באר. אוטמים את הצלחות בניילון נצמד וסובבים את הצלחות ב-1,150 גרם למשך ארבע שעות בחום של 32 מעלות צלזיוס. לאחר חיטום, החלף בזהירות את המדיה בכל באר בסופרנטנט תאי T שנשמר בעבר. ביום השישי, אספו תאי T מהצלחת לתוך צינור חרוטי וצנטריפוגה. שוטפים את הגלולה עם PBS המכיל סידן ומגנזיום. העבירו את התאים ללוחית תרבית חדשה המכילה 130 יחידות למיליליטר של אינטרלוקין-2 של עכבר ו-10 ננוגרם למיליליטר של אינטרלוקין-7 של עכבר. לדגור על התאים למשך יומיים לפחות או עד שהם מגיעים לרמת ההתפשטות הרצויה על סמך מספר התאים הדרושים להזרקה. ביום השמיני, צנטריפוגה ב-450 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לגלול את התאים. הוסף חמישה מיליליטר של Histopaque-1077 בצינור של 15 מיליליטר. השעו מחדש את גלולת תאי ה-T בחמישה מיליליטר PBS המכילים סידן ומגנזיום. שכב בזהירות את תרחיף התא על גבי חמישה מיליליטר של Histopaque-1077 בצינור הצנטריפוגה. צנטריפוגה את הדגימה ב-400 עד 500 גרם למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, מה שמבטיח ששבירת הצנטריפוגה או התאוצה מוגדרת ל-0. לאחר צנטריפוגה, שימו לב להיווצרות שכבות תאים נפרדות. אסוף בזהירות את שכבת הממשק המכילה את התאים הרצויים באמצעות פיפטה, הימנע מזיהום בשכבות אחרות. תאי T מתמרים GPR25 הראו הגירה משופרת לכיוון hCXCL17 ו-mCXCL17 ביחס לבקרות מתומרות ממלאות, ואימתו את ביטוי הקולטן הפונקציונלי. GPR25 התמיר תאים הממוקמים באופן מועדף לרקמות ריריות שאינן מעיים, כגון דרכי המין, הקיבה וקנה הנשימה, עם העשרה משמעותית שנצפתה לאחר שבעה שבועות, אך לא שבוע לאחר ההזרקה. מבחני ביות לטווח קצר הראו כי GPR25 התמיר תאי T המועדפים על איברים עשירים ב-Cxcl17, כגון קנה הנשימה, הקיבה, הלשון, כיס המרה ורירית הרחם, בעוד שלא הצליח להצטבר בעכברים חסרי Cxcl17. GPR25 התמיר תאים בעיקר בסמפונות, בעוד שתאי ביקורת נמצאו בתדירות גבוהה יותר ליד ורידים.