יישום של הידרוג'ל היאלורונן חדשני לתרבית זקיקים תלת מימדית ומתודולוגיה לשימור הקפאה של זקיקי שחלות עכבר

מחקר זה התמקד בפיתוח מערכת תרבית תלת מימדית לצמיחת זקיקים במבחנה והבשלת ביציות. יצירת מערכת כזו המשתמשת ברכיבים של המטריצה החוץ-תאית המקורית של התא תשפר את התפתחות הזקיקים. האתגר הגדול ביותר הוא יישום הידע ממודלים של בעלי חיים על תרבית זקיקים אנושית.

הגישה לרקמת שחלה אנושית מוגבלת. וזקיקים אנושיים דורשים זמן ארוך משמעותית בתרבית כדי להשיג הבשלת ביציות. מודל התרבות התלת-ממדית שפותח במחקר זה עשוי להיות שימושי במיוחד לטיפוח זקיקי שחלות אנושיים, ולאפשר שמירה על ארכיטקטורה תלת מימדית במהלך הזמן הממושך הדרוש בתרבית להבשלת הביציות.

כדי להתחיל, השג שחלות מגורי עכברים B6D2F1 בני 10 עד 14 יום לצורך ההליך. פיפטה 6 מיליליטר של מדיום תרבית זקיקים מאוזן מראש, או FCM, לשתי צלחות של 60 מילימטר וכיסוי בשמן מינרלי, ודגירה. פיפטה 1 מיליליטר קולגנאז לבאר המרכזית של המנה, ו -3 מיליליטר של רקמת שחלה, או מדיה OT, בבאר החיצונית.

העבירו את השחלות לתמיסת הקולגנאז. בתום הדגירה של הקולגנאז, העבירו את השחלות שטופלו בקולגנאז לבאר החיצונית לשטיפה. החלף מיקרופיפטות והעביר את השחלות לכלי טרי מלא במדיום OT.

כדי לקצור את הזקיקים, שאפו שוב ושוב והוציאו רקמת שחלה שטופלה באנזים דרך קצות פיפטות שנחתכו לגדלים שונים. להקניט רקמות באופן מכני באמצעות 27 מחטים עד לשחרור שמונה זקיקים. בדוק תחת מיקרוסקופ מנתח בהגדלה של פי 40 ובחר זקיקים פרה-אנטרליים משניים עם ביצית במיקום מרכזי הסגורה בתוך קרום בסיס שלם לצלחת OT טרייה.

מניחים את צלחת ה-FCM2 בחממה למשך 60 דקות לפני תחילת תהליך ההטמעה. הכינו שתי טיפות של 25 מיקרוליטר של ג'ל HA ללא מי חמצן על המכסה לשטיפה. העבר זקיקים או אשכולות זקיקים שיוטמעו מצלחת ה-FCM לטיפה של ההיאלורונן, או ג'ל HA, כדי לשטוף ללא מדיום תרבית.

הנח את צלחת ה-FCM בחזרה מתחת למבעבע לגז. להטמעת זקיקים, הניחו 1 מיקרוליטר של טיפת מי חמצן 0.03% על מכסה צלחת 60 מילימטר. כעת, הוסיפו 25 מיקרוליטר של 3 מיליגרם למיליליטר ג'ל HA וערבבו.

פיפטה כשמונה עד 10 מיקרוליטר מתערובת מי החמצן HA לשתי בארות נפרדות של צלחת שמונה הבארות. והעבירו במהירות את הזקיקים, אשכולות הזקיקים או שברי רקמת השחלה למרכז כל טיפה. ודא שאין בועות בתוך הטיפה.

לאחר שלוש דקות, הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית זקיקים מאוזן מראש לכל באר. שכבו בשמן מינרלי חם ודגרו על המנה. הכינו את הציוד והפתרונות הנדרשים לתהליך הזיגוג.

מקם את מנשא ה-RI בחריץ בקופסת הקריו המכילה חנקן נוזלי. הניחו שתי טיפות של תמיסת ויטריפיקציה שחוממה מראש 1, או VS1, זו לצד זו על מכסה של צלחת 60 מילימטר ליד החלק העליון. כעת, הניחו שני זקיקים בטיפה הראשונה, שטפו והעבירו אותם במהירות לטיפה השנייה של VS1 למשך חמש דקות דגירה.

בזמן שהזקיקים דוגרים, בצע שלוש טיפות VS2 ממש מתחת לטיפות VS1. לאחר מכן העבירו במהירות את הזקיקים ברצף דרך שלוש טיפות ה-VS2 תוך 60 שניות. לצורך זיגוג, הרם את הזקיקים מ- VS2.

הצג את נושא ה-RI תחת טווח הניתוח. והתאם את המיקוד כדי לדמיין את החור הזעיר במקל הפלסטיק. הפקידו זקיקים עם מינימום נוזלים לתוך החור.

זרוק את מקל הפלסטיק לתוך הקש החיצוני שהתקרר מראש. והשתמש בסילר קולי כדי לסגור את הקש. מניחים את הקש בגביע המחובר למקל הקריו.

מכסים את המקל בשרוול מגן מפלסטיק וצוללים אותו לחנקן נוזלי. לזיגוג מנשא פתוח, הכן את המנשא על ידי הכנסת גזע המתכת CL למכסה הבקבוקון הממוגנט, תוך הבטחת אחיזה יציבה. הנח מתלה בקופסת הקריו כדי להחזיק בקבוקוני קריו, וודא שחנקן נוזלי נמצא מתחת לחלק העליון של הבקבוקונים.

מלאו בקבוקון קריו מומצא ממוגנט בחנקן נוזלי והניחו במתלה. אחוז במנשא הפתוח CL במכסה המגנטי המצורף שלו באמצעות שרביט מגנטי. טבלו את מנשא ה-CL בטיפה נפרדת של VS2 כדי ליצור סרט מגן קריאה.

הרם את כל הזקיקים או אשכולות הזקיקים והנח אותם על הסרט עם מינימום נוזלים. טבלו מיד את ה-CL בבקבוקון הקריו המלא בחנקן נוזלי כדי לזלזל את הדגימה. הנח את בקבוקון הקריו על מקל הקריו, ולאחר מכן כסה בשרוול פלסטיק.

צללו את המקל למיכל אחסון חנקן נוזלי. מכינים צלחת באר מרכזית עם 3 מיליליטר FCM מאוזן מראש בבאר החיצונית ו -1 מיליליטר בבאר המרכזית. לאחר כיסוי המדיום בשמן, הניחו את המנה מתחת למבעבע לגז.

מניחים 0.5 מיליליטר של תמיסות חימום WS1 ו-WS2 מאוזנות מראש ל-37 מעלות צלזיוס לשתי צלחות באר מרכזיות מסומנות. העבר את קני הקריו עם דגימות ממיכל האחסון לקופסת קריו מלאה בחנקן נוזלי. ראשית, הסר את מכסה קנה הפלסטיק.

לאחר מכן שמור את הקש טבול, הסר אותו מהגביע והחלק אותו לתוך חריץ האחיזה בקופסת הקריו. חותכים את הקש החיצוני ממש מעל הנקודה השחורה. הרם את מקל הפלסטיק הפנימי מהקשית החיצונית וטבל במהירות את המקל לתוך WS1, תוך ערבוב עדין כדי לפרוק את הזקיקים תוך 10 שניות.

לאחר שתי דקות ב-WS1, השתמש במיקרו-פיפטה כדי להעביר זקיקים או אשכולות זקיקים ל-WS2 למשך שלוש דקות דגירה. לאחר מכן העבירו אותם לצלחת FCM ודגרו את הזקיקים למשך שעה עד שעתיים במרכז הרבה לפני ההטמעה, לחימום CL מנשא פתוח, חזור על הכנת צלחת FCM ו-WS. העבירו את מקל הקריו לקופסת קריו והסירו את מכסה קנה הפלסטיק.

השתמש בשרביט מגנטי כדי להרים את מכסה בקבוקון הקריו עד שגזע המתכת של ה-CL נראה לעין. אחוז במכסה עם מנשא ה-CL המצורף באמצעות השרביט המגנטי. וטבול במהירות את ה-CL לתוך WS1, תוך סיבוב כדי לפרוק זקיקים תוך 10 שניות.

צמיחת הזקיקים הקדם-אנטרליים נשמרה בתרבות הג'ל ההיאלורונן התלת מימדית, תוך שימור ארכיטקטורת הזקיקים המקומית עם אנטרום הנראה עד היום ה-12. זקיקים עטופים בג'ל היאלורונן הראו התרחבות רדיאלית עקב התפשטות תאי גרנולוזה עם קוטר זקיקים שגדל מסביבות 139.8 מיקרומטר ל-385.6 מיקרומטר במהלך תקופת התרבית. ביציות מטאפאזה שתי ביוציות נמצאו ליד הזקיק לאחר טריגר גונדוטרופין כוריוני אנושי.

הביציות נמדדו בקוטר של כ-84.8 מיקרומטר. עם שחלות טריות, גם זקיקים בודדים וגם אשכולות זקיקים הראו שיעורי התבגרות טובים. אשכולות זקיקים משחלות שמורות בהקפאה הראו שיעורי התבגרות נמוכים יותר שהובילו לשחול ביציות מוקדם.

שימור הקפאה של זקיקים מבודדים היה יעיל יותר משימור שחלות שלמות. ויטריפיקציה של זקיקים בשני הנשאים השיגה שיעורי התבגרות גבוהים, ללא קשר להבדלי קצב הקירור. מערכת המנשא הפתוח CL אפשרה שימור יעיל בהקפאה של זקיקים מרובים, והפחיתה את זמן העיבוד.