פרוטוקול יעיל להערכת אפנון פעילות ERK במודלים מוקדמים של תסמונת נונן של דג הזברה באמצעות מיקרוסקופ FRET חי ואימונופלואורסצנציה
2 במאי 2025
RASopathies הן תסמונות גנטיות רב-מערכתיות הנגרמות על ידי היפראקטיביזציה של מסלול RAS-MAPK. וריאנטים פתוגניים פוטנציאליים הממתינים לאימות מופיעים ללא הרף בעוד ראיות פרה-קליניות גרועות מגבילות את הטיפול. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ה-in vivo שלנו לבדיקה ואימות צולב של רמות הפעלת ERK הקשורות ל-RASopathy ואת האפנון הפרמקולוגי שלו במהלך האמבריוגנזה על ידי הדמיית FRET חיה בדג זברה Teen-reporter.
אנו מייצרים מודל דגי זברה למחלות התפתחותיות מורכבות, המקשר בין ריצוף מטופלים לגנומיקה פונקציונלית, כדי לתמוך בפרשנות וריאנטים וגם בבדיקות תרופות פרה-קליניות. למרות שיפור בחיישני ה-FRET, מבחן חי עמיד לזיהוי שינויים פתוגניים עדינים באותות Ras-MAPK עם רגישות מרחבית-זמנית מספקת עדיין חסר. כדי להתחיל, הניחו את לוח המיקרו-הזרקה מותאם אישית המכיל 2% אגרוז יצוק במדיום E3 על פלטפורמת עבודה.
סדר ויישר את ביצי דג הזברה המופרות בצלחת למסלולים מתאימים כדי להגביל את תנועת הביציות במהלך הזרקת מיקרו. העמיס את המחט לאחור עם שני מיקרוליטרים של חומר הזרקה באמצעות פיפט מיקרולודר. כוון את הגדרות הלחץ והזמן כדי לכייל כל הזרקה לפי איכות המחט והעובר במכשיר המיקרו-הזריקה.
הזרקו את התמיסה לשלב התא היחיד של עוברי דגי זברה מתבגרים. גידול עוברים צעירים עם הזרקה מיקרו בתנאי תחזוקה מבוקרים. נקו כל ביצה שנראית מעוננת או מתנוונת בתוך שלוש שעות מהשקיעה.
כארבע שעות לאחר ההפריה, באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנציה סטנדרטי, הגדרה לטווח אורכי גל של 465 עד 500 ננומטר. סקר את העוברים לביטוי של דיווח פלואורסצנטי. בחרו דגים חיוביים לבני נוער להדמיית FRET ואחים שליליים בשמורה להערכות אימונוהיסטוכימיות.
הניחו בריכות עוברים במספר שווה לבארות שונות של צלחת בעלת שישה בארות. להתחלת הטיפול, טבלו את העוברים בשלושה מיליליטר של מדיום E3 המכיל שליטה ברכב כ-DMSO או MEK מדולל בריכוז הרצוי. כדי להתחיל, המיס את האליקווט של אגרוז נמס ב-1.5% עד 2% בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס.
לאחר המיסה, הורד את הטמפרטורה לכ-30 מעלות צלזיוס. מקמו עובר נער חיובי יחיד שהוזרק במרכז צלחת תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ להדמיה חיה. הסר עודף מדיום E3, והוסיף טיפה של אגרוז נמס נמוך כדי לייצב את העובר.
תן לאגרוז לפולימר בטמפרטורת החדר. הפעל את בקר האינקובטור לפחות שעה לפני הרכישה והגדר את הטמפרטורה ל-28 מעלות צלזיוס כדי לשמור על בריאות העובר. לאחר שהאינקובטור מתייצב, הניחו את צלחת ההדמיה עם העובר על מחזיק הדגימה והשתמשו באובייקטיב יבש פי 10 כדי להמחיש את הדגימה.
הפעל את לייזר הארגון יון וכוון את עוצמת הלייזר ל-50% בהגדרות חומרה, בחר ברזולוציית עומק של שמונה ביט כדי לצלם תמונות. לאחר מכן, בפאנל הרכישה, בחר את מצב הסריקה xy, gamma, lambda, z, והגדר את התמונה ל-512 על 512 פיקסלים, מהירות סריקה של 400 הרץ וזום אופטי של 0.75. הפעל את קו הלייזר בקוטר 458 ננומטר של לייזר יון ארגון, והגדר את ערך העוצמה שלו ל-8.5%. לאחר מכן בחר גלאי היברידי והגדר את הרגישות שלו לערך הגבר של 500.
פתח את תפריט הנפתח בשורת הגלאי כדי לבחור את עקומת הפליטה של חלבון פלואורסצנציה ציאן או ECFP. כדי להציג את עקומת הפליטה של YPET, הפעל גלאי שני. לאחר מכן בחרו את עקומת הפליטה YFP של חלבון פלואורסצנציה צהוב.
כדי להתחיל רכישות חיות, מקם את סמן הזיהוי בטווח של אות YFP האינטנסיבי ביותר כדי להמחיש את הדגימה. הגדר את מיקום ההתחלה והסוף של עובי הדגימה בחלון Z-Stack LASX. הגדר את תכונות טווח סריקת הגמא שיתחילו ב-460 ננומטר ויסתיימו ב-570 ננומטר מטווח הגילוי.
הגדר את רוחב הפס של הגילוי כחמישה ננומטרים וגודל שלב הסריקה כחמישה ננומטרים. התחל ברכישת z-stack. הכנס ושמור שני ספקטרום פליטת ייחוס מותאמים עבור CFP ו-YFP במסד הנתונים של הצבעים הזמין בחלון הקונפיגורציה כדי להחריג דליפה ספקטרלית.
בחר את קובץ התמונה הספקטרלית שנוצר ממושב ההדמיה ופתח את חלון התהליך. לאחר מכן, בכלי הפרדת הצבע, בחר ב-Spectral Dye Separation, והגדר את ההגדרות להפרדת הצבע. ברשימות הנפתחות בצד שמאל של הדיאלוג, בחרו את ספקטרום פליטת ה-CFP החדש במיקום הראשון ואת ספקטרום פליטות ה-YFP החדש ממאגר הספקטרום.
בסריקת הגמא של התמונות, יש לזהות את התמונה עם עוצמת האות הגבוהה ביותר. לאחר מכן התקדמו לאורך סריקת ה-z כדי לבחור את החלק האופטי שמדגיש את אזור העניין באזור השוליים. הפעל את מצב בחירת התשואה באזור השוליים של עמוד החיה כדי להגדיר את האזור עם הספקטרום הטוב ביותר.
לחץ על כוונת ROI בחלון התצוגה והתאים את גודל ה-ROI הייחוס ל-40 ווקסלים באזור המדידות. פתח את הקובץ החדש שנוצר ומכיל את שני הערוצים המופרדים. הפיק תמונת הקרנה דו-ממדית מתוך סדרת התמונות התלת-ממדיות באמצעות הקרנה בעוצמה מרבית.
בחלון התהליך, בחר לחתוך כדי להפריד ערוצים לשני קבצים נפרדים, ערוץ אחד וערוץ שניים. בחלון התהליך, בחר ב-Combine Images, ואז בחר את קובץ הערוץ השני והכניס אותו לאופציה הראשונה. לאחר מכן בחר את קובץ הערוץ הראשון והכנס אותו לאפשרות השנייה.
הגדר שינוי קנה מידה עם גורם חמש ובחר את פעולת היחסים. לחץ על Apply כדי ליצור קובץ חדש המכיל את תמונת מדד היחס. שמור את הקובץ לניתוח נתונים.
ייבא את קבצי ההדמיה הספקטרלית ותמונות הפרדת צבע לתוכנת פיג'י בקוד פתוח לניתוח. הגדר פרמטרים למדידות קריאה בפיג'י באמצעות ניתוח והגדרת מדידות. בחר שטח, צפיפות משולבת וערך אפור ממוצע כפרמטרים מעניינים.
באמצעות כלי בחירת הפוליגונים מתוך סרגל הכלים, בחרו את האזור הרלוונטי לשוליים של הגסטרולה. בהמשך, לחץ על ניתוח, כלים ומנהל ROI כדי לשמור את מפרט ה-ROI xy. כדי לבצע מדידות בתשואה מסוימת נבחרת, לחצו על ניתוח ומדידה.
ארגן ערכי יחס FRET לפי CFP עבור כל ROI בגיליון עבודה עם קבוצות ניסוי בעמודות וערכים גולמיים בשורות. עבור שכפול ביולוגי יחיד, צור טבלת עמודות עם משתנה קיבוץ אחד, כאשר כל קבוצה מוגדרת על ידי עמודה. בסיום הגסטרולציה, מקבע את העוברים באמצעות טבילה ב-4% פראלדהיד המוכן ב-PBS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר הקיבוע יש לשטוף את העוברים מספר פעמים עם PBS. באמצעות פיפטת פסטור, כוון את העוברים לרוחב בתוך באר אחת של צלחת בת 12 בארות המכילה PBS טרי. באמצעות מיקרוסקופ סטריאו עם מטרה בהגדלה של 2.7x, מטרת סריקה של 0.63x ופקטור זום של 8.6, לצלם את התמונות במצב שדה בהיר כדי להעריך את נוכחות הצורה האובלית.
ייבא את תמונת העובר שצולמה לתוכנת פיג'י. כדי למדוד את אורך צירי העובר, בחרו את הכלי הישר בסרגל הכלים ולחצו על ניתוח, ואחריהם מדידה. לאחר ביצוע מדידות נבחרות, הוסף אותן לרשימת מנהל ה-ROI ושמור את קובץ ה-ROI.
ייצא את הנתונים לגיליון עבודה. חשב את יחס הצירים על ידי חלוקת אורך הציר הראשי באורך הציר הקטן. חשב את הממוצע, את סטיית התקן של הממוצע, או את שגיאת התקן של הממוצע של שכפולים שונים.
צינור ה-FRET החי שלנו בדגי זברה מאפשר גילוי רגיש מוקדם של הפעלת איתות ERK פתוגני, תמיכה בפרשנות וריאנטים ובדיקת יעילות מעכבי MEK.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול in vivo המשתמש בדגי זברה כדי לחקור רמות של אקטיבציה של ERK הקשורות ל-RASopathy באמצעות הדמיית FRET בזמן אמת. הגישה שואפת לאמת וריאציות פתוגניות ולהעריך מודולציה פרמקולוגית במהלך התפתחות העובר.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- נוירו-מדע
- גנטיקה
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- RASopathies הם תסמונות גנטיות הקשורות להיפר-אקטיבציה של נתיב RAS-MAPK.
- וריאציות מתעוררות דורשות אימות לצורך פיתוח טיפול יעיל.
- הראיות הקליניות הנוכחיות מוגבלות, מה שמחייב מודלים משופרים.
- הדמיית FRET בזמן אמת מציעה גישה חדשה לחקר אקטיבציה של ERK in vivo.
מטרת המחקר
- לבחון רמות של אקטיבציה של ERK הקשורות ל-RASopathy בדגי זברה.
- לאמת וריאציות פתוגניות אפשריות הקשורות ל-RASopathies.
- לחקור מודולציה פרמקולוגית במהלך התפתחות העובר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור מודלי דגי זברה למחלות התפתחותיות מורכבות.
- קישור נתוני רצף מטופלים לגנומיקה תפקודית.
- הזרקה מיקרוסקופית של ביצי דגי זברה מופרות עם חומרים מותאמים אישית.
- שימוש בחיישני FRET לגילוי שינויים באיתות Ras-MAPK.
תוצאות עיקריות
- יישור והזרקה מוצלחים של ביצי דגי זברה להתאמה עקבית לניסויים.
- הוכחת רגישות מרחבית-זמנית בגילוי אקטיבציה של ERK.
- אימות של המבחן in vivo להערכת שינויים פתוגניים.
- פוטנציאל לשיפור מתודולוגיות של בדיקת תרופות פרה-קליניות.
מסקנות
- המחקר מספק מסגרת חזקה לחקר RASopathies.
- הדמיית FRET בזמן אמת היא כלי מבטיח לניתוח בזמן אמת של מסלולי איתות.
- מחקר עתידי יכול לבנות על ממצאים אלו כדי לשפר אסטרטגיות טיפוליות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Rapid in vivo assessment of ERK activity modulation in zebrafish enables early-stage functional validation of RASopathy-associated variants, directly supporting target validation and mechanistic de-risking in rare disease pipelines. The protocol's integration of live FRET imaging and immunofluorescence provides quantitative, reproducible outputs essential for preclinical evaluation of pharmacological modulators. This scalable approach enhances predictive confidence and accelerates variant triage for portfolio advancement in genetic disease research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of RAS-MAPK pathway variants in a live vertebrate system.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying ERK signaling changes linked to pathogenic mutations.
- Facilitates rapid triage of candidate variants for downstream therapeutic exploration.
Screening & Assay Development
- Provides a validated, quantitative readout of ERK activity for assay standardization.
- Delivers reproducible FRET-based measurements suitable for pharmacological screening of MEK inhibitors.
- Supports scalability and platform reuse in cost-effective zebrafish models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns early functional outputs with disease-relevant phenotypes for translational continuity.
- Enables preclinical assessment of drug repositioning candidates in a whole-organism context.
- Reduces biological risk by linking molecular activity to morphometric outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol bridges early discovery and preclinical validation by enabling real-time ERK activity measurement and pharmacological testing in zebrafish embryos.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and variant interpretation through live ERK activity quantification.
- Screening: Establishes assay readiness and reproducibility for MEK inhibitor evaluation.
- Analytics: Provides ratiometric FRET and morphometric data for robust statistical comparison.
- Translational Research: Connects molecular signaling changes to phenotypic outcomes relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for diverse RASopathy and pathway-targeted studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in variant pathogenicity and drug response.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible in vivo assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and reduces late-stage biological uncertainty.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic targets and therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish microinjection and live imaging techniques.
- Needs access to multispectral FRET-capable confocal microscopy and image analysis software.
- Demands cross-team standardization of imaging and data analysis protocols.
- Adaptation may be needed for different genetic backgrounds or pathway targets.
- Throughput is limited by embryo handling and imaging capacity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:30
Microinjection and Treatment of Zebrafish Embryos for FRET Imaging and MEK Inhibition Assays
2:13
Live Multispectral FRET Imaging of RASopathy Zebrafish Models
4:57
Postprocessing and Dye Separation for Ratiometric FRET Imaging
7:03
Quantitative Analysis of FRET Signals and Image Rendering
8:14
Assessment of Morphological Phenotypes and Image Analysis in Zebrafish Embryos
9:41
Conclusion
