בידוד ותרבות של אדיפוציטים עכבריים ראשוניים מעכברים רזים והשמנים
24 בינואר 2025
הגודל והשבריריות של אדיפוציטים בוגרים הגבילו את הטכניקות והכלים הזמינים למחקר ולבידוד שלהם. כאן, מתואר פרוטוקול לבידוד של אדיפוציטים עכברים בוגרים, שניתן להתאים בקלות למחסני שומן שונים ולדיאטות עכברים.
המחקר שלנו מתמקד בחקירת התפקוד של אדיפוציטים בוגרים ממאגרי שומן שונים ומצבים תזונתיים. אנו מתעניינים במיוחד בהבנת האופן שבו אדיפוציטים בוגרים מתקשרים עם התאים הסובבים, וכיצד הדיבור ההדדי הזה יכול להשפיע על התקדמות המחלה ולהשתנות בהשמנת יתר. אדיפוציטים בוגרים הם תאים גדולים ועדינים, מה שהופך את שיטות בידוד התאים הנפוצות כגון FACS ללא יעילות.
יתר על כן, רמות גבוהות של שומנים חופשיים הנמצאים לעתים קרובות ברקמת השומן עלולות להיות רעילות לאדיפוציטים בוגרים ולסבך את תחזוקתם. בניגוד לשיטות נפוצות המסתמכות על התמיינות במבחנה של פרה-אדיפוציטים, פרוטוקול זה מאפשר לנו לחקור אדיפוציטים מבודדים ex vivo, שהם דומים מבחינה תפקודית ושעתוק לאדיפוציטים in vivo. זה חשוב במיוחד מכיוון שאדיפוציטים משתנים מאוד בין מצבורי שומן ובתנאי תזונה שונים.
פרוטוקול זה מבודד ביעילות, משקף אדיפוציטים בוגרים וניתן להרחבה בקלות. התאמות כלולות כדי לייעל את הבידוד של אדיפוציטים מעכברים ממינים שונים ועם תנאים תזונתיים שונים. לאחר הבידוד, ניתן לתרבת, לדמות או להשתמש בכל דרך אחרת לפי הצורך.
כדי להתחיל, הכינו תמיסת קולגנאז עם DNase על ידי הוספת 0.00017 גרם DNase למיליליטר אחד של תמיסת קולגנאז, ומערבלו את התערובת כדי להבטיח ערבוב מלא. בעזרת סכין גילוח, טוחנים את רקמת השומן של העכברים המבודדים עד שהיא נראית הומוגנית. לאחר מכן העבירו את רקמת הטחון לצינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר.
הוסף את תמיסת הקולגנאז וה-DNase המוכנה לרקמת השומן הטחונה והמערבולת במהירות מקסימלית למשך שבע עד 10 שניות כדי לערבב היטב את הרכיבים. לאחר מכן הנח את הצינורות החרוטיים של 50 מיליליטר אופקית בשייקר המוגדר ל-220 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר הדגירה, הסר את הצינורות, מערבולת למשך חמש שניות ובדוק את הדגימות.
כעת באמצעות פיפטה סרולוגית, העבירו את הרקמה המעוכלת דרך מסננת לצינור חרוטי סטרילי חדש של 50 מיליליטר. הוסף FBS השווה לנפח הרקמה ותמיסת הקולגנאז דרך המסננת לאותו צינור חרוטי כדי לנטרל את הקולגנאז. סובב את הצינורות בחום של 300 גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורה המצוינת בטבלה המוצגת כאן.
לאחר מכן בעזרת פיפטה של 200 מיקרוליטר, השליכו בזהירות את השכבה העליונה של השומנים החופשיים. לאחר מכן, השתמש בפיפטה P1000 כשהקצה מנותק כדי להעביר את האדיפוציטים הבוגרים לצינור מוכן של 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של אמצעי גידול. הפוך בעדינות את הצינורות של 15 מיליליטר המכילים אדיפוציטים בוגרים שלוש עד חמש פעמים עד שהשכבה הלבנה מתפזרת בכל המדיה.
לאחר הנחת הצינורות למשך 10 דקות, סובב אותם בטמפרטורה שנקבעה בעבר כדי להפריד עוד יותר את השכבות. לאחר מכן, השתמש בפיפטה כדי להשליך את השכבה העליונה של השומנים החופשיים. כעת חבר מחט בגודל 21 למזרק של חמישה מיליליטר והחלק בזהירות את המחט במורד קצה הצינור עד שתחתית המחט נמצאת מתחת לשכבת אתר השומן הבוגר.
לאחר מכן משוך לאט את המזרק כדי להסיר את אמצעי התרבות וכל פסולת סלולרית. הוסף בעדינות 10 מיליליטר של אמצעי תרבות לצינור. באמצעות קצות פיפטה לטעינת ג'ל החלק את הקצה במורד קצה הצינור כדי להסיר את המדיה שנותרה מתחת לשכבת השומן הבוגרת.
ואז צנטריפוגה את התאים ב 100 גרם למשך דקה אחת. בעזרת פיפטה הסר את השומנים החופשיים. בעזרת קצה פיפטה לטעינת ג'ל הסר את אמצעי התרבית מתחת לאדיפוציטים.
הסר את תוספות תרבית התאים מצלחת 24 בארות שטופלה בתרבית רקמות והנח אותן עם הממברנה כלפי מעלה על פני מכסה המנוע. מלאו בארות לסירוגין של הצלחת באמצעי תרבות חם. בעזרת קצה פיפטה P200 חתוך, העבירו 30 מיקרוליטר של אדיפוציטים בוגרים ארוזים על החלק העליון של תוספת Transwell.
לאחר מכן הרם בזהירות את תוספת הטרנסוול, הפוך אותה והניח אותה לבאר ממולאת מראש בצלחת 24 הבארות. כדי להוציא את המדיה מהבארות, החזיקו את ה-Transwell יציב ושאבו עם פיפטה P200 דרך הפתחים הקטנים בצדדים. לאחר הסרת המדיה, תוך כדי החזקת ה-Transwell במקומו, הוסיפו לאט מיליליטר אחד של מדיה טרייה לאורך דופן הבאר.
סקירה כללית
מחקר זה עוסק באתגר של בידוד אדיפוקיטים בוגרים ממאגרי שומן שונים תחת תנאי תזונה משתנים. הוא מציג פרוטוקול ניתן להרחבה המאפשר ניתוח פונקציונלי של תאים רגישים אלו, אשר הם חיוניים להבנת תפקידם בהשמנה ובמחלות אחרות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- ביולוגיה של אדיפוציטים
- מחקר על השמנה
- טכניקות לבידוד תאים
רקע
- אדיפוציטים בוגרים הם גדולים ושבירים
- שיטות בידוד סטנדרטיות הן לרוב לא יעילות
- אפיון מאגרי השומן משתנה בהתאם להשפעות תזונתיות
שיטות שבהן נעשה שימוש
- בידוד של אדיפוציטים בוגרים באמצעות קולגנאז ו-DNase
- מודל מחקר ex vivo עם תאים עכבריים
- פרוטוקול ניתן להרחבה הניתן להתאמה לתנאי תזונה ולמינים שונים
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של אדיפוקיטים בוגרים המשקפים מאפיינים in vivo
- מתודולוגיה מותאמת לסוגים שונים של רקמות שומן
- פרוטוקול המאפשר תרבית המשך והדמיה למחקרים פונקציונליים
מסקנות
- המחקר מספק פרוטוקול מהימן למחקר של אדיפוציטים (תאי שומן)
- משפר את ההבנה של תפקוד האדיפוציטים במצב בריאותי ובמצב מחלה
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד ותרבית אמינים של אדיפוקיטים ראשוניים מעכברים מדגמי רזון והשמנה פותרים צוואר בקבוק קריטי במחקר של מחלות מטבוליות ובתיקוף מטרות (target validation). פרוטוקול זה מאפשר בחינה תפקודית של ביולוגיית האדיפוקיטים, ובכך תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים ובהמשכיות תרגומית בין דגמים של מחלות המונעות מהשמנה. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי עבור תוכניות גילוי מוקדמות ותוכניות פרה-קליניות המתמקדות בתפקוד רקמת השומן ובסיגנל אנדוקריני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ניתוח תפקודי ישיר של אדיפוציטים בוגרים ממאגרי שומן שונים וממצבים תזונתיים שונים.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי שימור פרופילים תעתוקיים ותפקודיים הדומים לאלו של in vivo.
- מקל על בדיקת היפותזות בנוגע למנגנוני מחלה המונעים על ידי אדיפוציטים ותקשורת בין-תאית.
- משפר את הביטחון החזיוי לבחירת מטרות במחקר מטבולי ואנדוקריני.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכות מאומתות של אדיפוציטים ראשוניים עבור בדיקות ליפוליזה וקו-קלטורה בהמשך התהליך.
- מאפשר הכנה הדירה של מצע גידול מותנה אדיפוציטים (conditioned media) לצורך ניתוח הסקרטום.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה וביכולת הרחבה (scalability) במודלים של רזים ואובזים, זכרים ונקבות.
- מכין פלטפורמות חזקות לסריקת תרכובות ולמדדים פונקציונליים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה ממצאים במבחנה (in vitro) לביולוגיה של רקמת שומן רלוונטית למחלה ממודלים פרה-קליניים.
- מאפשר רצף משלב הגילוי ועד써 לאישור פרה-קליני של התערבויות המכוונות לתאי שומן (אדיפוציטים).
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי שיקוף של תפקוד אדיפוקיטים (תאי שומן) in vivo.
- מקל על גילוי סמנים ביולוגיים באמצעות ניתוח של גורמים המופרשים על ידי אדיפוקיטים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
פרוטוקול זה משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי כך שהוא מאפשר ניתוח ex vivo של תפקוד האדיפוציטים, ובכך תומך הן בתיקוף מטרות (target validation) והן במחקר תרגומי במסלולי פיתוח למחלות מטבוליות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מנגנוני של תפקידי האדיפוציטים במחלות.
- סריקה: מספקת תכשירים של אדיפוציטים הניתנים לשחזור, ספציפיים למאגר שומן ולתזונה, לצורך פיתוח בדיקות (assays).
- אנליטיקה: מספקת פלטים כמותיים למחקרי ליפוליזה, תרביות משולבות (co-culture) ומחקרי סקרטום.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין ממצאים in vitro לממצאים in vivo לצורך התאמה של מודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פרוטוקול סקילבילי וניתן להתאמה עבור תוכניות מחקר מטבוליות ואנדוקריניות מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במודלים של מחלות המונעות על ידי אדיפוקיטים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של בידוד ותרבית על פני מין, מאגר שומן ותנאי תזונה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות נחרצת (go/no-go) ומיון יעיל של תיקי פיתוח מבחינת הון במחקר מטבולי.
- השפעה על תיק הפיתוח: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של תוכניות טיפוליות המכוונות לאדיפוקיטים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בבידוד תאים ראשוניים ובטיפול באדיפוציטים שבירים.
- דורש גישה לתשתיות תרביות רקמה וכלי פיפטה ייעודיים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים כדי להבטיח שחזוריות בין מודלים ותנאים שונים.
- ניתן להתאמה למודלים עכבריים רזים ואובסיים, זכרים ונקבות.
- המגבלות כוללות את טבעם העדין של אדיפוציטים בוגרים ורעילות ליפידית פוטנציאלית במהלך הבידוד.
