Name: בידוד ותרבות של אדיפוציטים עכבריים ראשוניים מעכברים רזים והשמנים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: למדו פרוטוקול לבידוד אדיפוציטים בוגרים מרקמות שומן שונות בעכברים תחת תנאי תזונה שונים. השיטה מאפשרת ניתוח תפקודי של תאים עדינים לחקר השמנת והמטבוליזם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>גידול אדיפוציטים ואקספלנטים של עכברים למחקרים פונקציונליים והדמיה

<ol><li>Ward, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projected+U.S.+state-level+prevalence+of+adult+obesity+and+severe+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Projected U.S. state-level prevalence of adult obesity and severe obesity.</a> N Engl J Med. 381 (25), 2440-2450 (2019).</li>
<li>Vishvanath, L., Gupta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+adipogenesis+to+healthy+adipose+tissue+expansion+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Contribution of adipogenesis to healthy adipose tissue expansion in obesity.</a> J Clin Invest. 129 (10), 4022-4031 (2019).</li>
<li>Longo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+dysfunction+as+determinant+of+obesity-associated+metabolic+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue dysfunction as determinant of obesity-associated metabolic complications.</a> Int J Mol Sci. 20 (9), 2358(2019).</li>
<li>Funcke, J. B., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+adiponectin+and+leptin%3A+Adipose+tissue-derived+mediators+of+inter-organ+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Beyond adiponectin and leptin: Adipose tissue-derived mediators of inter-organ communication.</a> J Lipid Res. 60 (10), 1648-1684 (2019).</li>
<li>Johnston, E. K., Abbott, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+paracrine-%2C+autocrine-%2C+and+matrix-dependent+signaling+during+the+development+and+progression+of+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue paracrine-, autocrine-, and matrix-dependent signaling during the development and progression of obesity.</a> Cells. 12 (3), 407(2023).</li>
<li>Koenen, M., Hill, M. A., Cohen, P., Sowers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+adipose+tissue+and+vascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Obesity, adipose tissue and vascular dysfunction.</a> Circ Res. 128 (7), 951-968 (2021).</li>
<li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+and+lipidomic+profiling+of+subcutaneous+and+visceral+adipose+tissues+in+15+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Data%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic and lipidomic profiling of subcutaneous and visceral adipose tissues in 15 vertebrates.</a> Sci Data. 10 (1), 453(2023).</li>
<li>Wu, Y., Li, X., Li, Q., Cheng, C., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-to-breast+cancer+crosstalk%3A+Comprehensive+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-to-breast cancer crosstalk: Comprehensive insights.</a> Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1877 (5), 188800(2022).</li>
<li>Emont, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+human+and+mouse+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue.</a> Nature. 603 (7903), 926-933 (2022).</li>
<li>Nahmgoong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+properties+of+adipose+stem+cell+subpopulations+determine+fat+depot-specific+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Distinct properties of adipose stem cell subpopulations determine fat depot-specific characteristics.</a> Cell Metab. 34 (3), 458-472.e6 (2022).</li>
<li>Hildreth, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+of+human+white+adipose+tissue+identifies+new+cell+states+in+health+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing of human white adipose tissue identifies new cell states in health and obesity.</a> Nat Immunol. 22 (5), 639-653 (2021).</li>
<li>Maniyadath, B., Zhang, Q., Gupta, R. K., Mandrup, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue at single-cell resolution.</a> Cell Metab. 35 (3), 386-413 (2023).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+promote+breast+tumorigenesis+through+taz-dependent+secretion+of+resistin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Adipocytes promote breast tumorigenesis through taz-dependent secretion of resistin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33295-33304 (2020).</li>
<li>Cornide-Petronio, M. E., Jimenez-Castro, M. B., Gracia-Sancho, J., Peralta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+liver-visceral+adipose+axis+during+hepatic+resection+and+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">New insights into the liver-visceral adipose axis during hepatic resection and liver transplantation.</a> Cells. 8 (9), 1100(2019).</li>
<li>Verma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-alpha-2-glycoprotein+secreted+by+triple-negative+breast+cancer+promotes+peritumoral+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Zinc-alpha-2-glycoprotein secreted by triple-negative breast cancer promotes peritumoral fibrosis.</a> Cancer Res Commun. 4 (7), 1655-1666 (2024).</li>
<li>Min, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+repertoire+of+human+adipocyte+subtypes+develops+from+transcriptionally+distinct+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Diverse repertoire of human adipocyte subtypes develops from transcriptionally distinct mesenchymal progenitor cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (36), 17970-17979 (2019).</li>
<li>Harms, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+human+white+adipocytes+cultured+under+membranes+maintain+identity%2C+function%2C+and+can+transdifferentiate+into+brown-like+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mature human white adipocytes cultured under membranes maintain identity, function, and can transdifferentiate into brown-like adipocytes.</a> Cell Rep. 27 (1), 213-225.e5 (2019).</li>
<li>Chaurasiya, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+visceral+adipose+tissue+microvascular+endothelial+cell+isolation+and+establishment+of+co-culture+with+white+adipocytes+to+analyze+cell-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Human visceral adipose tissue microvascular endothelial cell isolation and establishment of co-culture with white adipocytes to analyze cell-cell communication.</a> Exp Cell Res. 433 (2), 113819(2023).</li>
<li>Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+primary+white+and+brown+pre-adipocytes+from+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of primary white and brown pre-adipocytes from newborn mice.</a> J Vis Exp. 167, e62005(2021).</li>
<li>Farrar, J. S., Martin, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+stromal+vascular+fraction+from+adipose+tissue+and+subsequent+differentiation+into+white+or+beige+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of the stromal vascular fraction from adipose tissue and subsequent differentiation into white or beige adipocytes.</a> Methods Mol Biol. 2455, 103-115 (2022).</li>
<li>You, X., Gao, J., Yao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+methods+to+mechanically+isolate+stromal+vascular+fraction%3A+A+concise+review%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Ther%22%5BJournal%5D)">Advanced methods to mechanically isolate stromal vascular fraction: A concise review.</a> Regen Ther. 27, 120-125 (2024).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cell+isolation+from+mouse+epididymal+adipose+tissue+and+sequencing+library+construction%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Progenitor cell isolation from mouse epididymal adipose tissue and sequencing library construction.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102703(2023).</li>
<li>Cho, D. S., Doles, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+adipose+progenitor+cells+from+mouse+epididymal+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues.</a> J Vis Exp. 162, e61694(2020).</li>
<li>Lauschke, V. M., Hagberg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+human+adipose+tissue+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Next-generation human adipose tissue culture methods.</a> Curr Opin Genet Dev. 80, 102057(2023).</li>
<li>Alexandersson, I., Harms, M. J., Boucher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+mature+adipocytes+using+membrane+mature+adipocyte+aggregate+cultures+%28MAAC%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (MAAC).</a> J Vis Exp. 156, e60485(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>תמיסת 100x פולוקסמר 188</td><td>סיגמא</td><td>P5556-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל חרוטי</td><td></td><td>Cellstar 188261</td><td></td></tr><tr><td>21 גרם מחט</td><td>BD</td><td>305165</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל מזרק</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל Cellstar חרוטי</td><td></td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>6.5 מ"מ Transwell עם 0.4 ומיקרו; m נקבוביות פוליקרבונט קרום הכנסת</td><td>קרום</td><td>3413</td><td></td></tr><tr><td>בקר סרום אלבומין (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016-500gm</td><td></td></tr><tr><td>CellMask כתמי קרום פלזמה</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10045</td><td></td></tr><tr><td>CL 316243 מלח דיסודיום</td><td>Tocris</td><td>1499</td><td></td></tr><tr><td>אבקת קולגנאז</td><td>Sigma</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>DMEM ללא pheonol</td><td>אדום Gibco</td><td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Gibco</td><td>A56708-01</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>1518848</tr><tr><td>ג'ל טעינת פיפט טיפ</td><td>פישר מדעי</td><td>02-707-181</td><td></td></tr><tr><td>תוסף GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת גליצרול</td><td>Abcam</td><td>AB133130</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer</td><td>Sigma</td><td>83264-100ml-F</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus צנטריפוגה Megafuge 16R</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>75004271</tr><tr><td>Hoechst 33342 פתרון</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>דגירה מיני שייקר</td><td>VWR</td><td>12620-942</td><td></td></tr><tr><td>בינוני 199</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M4530</td><td></td></tr><tr><td>משקפי כיסוי מיקרוסקופ</td><td>VWR</td><td>16004-302</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>מרווחי הדמיה SecureSeal</td><td>Grace Biolabs</td><td>654006</td><td></td></tr><tr><td>Seive (מסננת קוקטייל רשת עדינה של SteeL)</td> <td>OXO</td><td>3112000</td><td>https://www.oxo.com/steel-fine-mesh-cocktail-strainer-660.html</td></tr></tbody></table>

בידוד ותרבות של אדיפוציטים עכבריים ראשוניים מעכברים רזים והשמנים

Isolation and Culturing of Primary Murine Adipocytes from Lean and Obese Mice

כפי שמוצג באיור 2, טחינה נכונה (איור 2B) ועיכול (איור 2C) חשובים לבידוד של אדיפוציטים בוגרים שלמים. תת-טחינה ותת-עיכול עלולים לגרום לתפוקה נמוכה של אדיפוציטים בוגרים עקב הפרדה לא מספקת מרקמת החיבור. מבחינה ויזואלית, ניתן לראות זאת עם רקמה חוטית שנותרה לאחר הטחינה וגושים גלויים בתמיסת קולגנאז. בנוסף, טחינת יתר ועיכול יתר גורמים גם לתפוקה נמוכה עקב התפוצצות השומנים הבוגרים. מבחינה ויזואלית, התוצאה היא אובדן השכבה הלבנה האטומה והצטברות של שכבת שומנים גדולה, שקופה וחופשית. רמות לא מתאימות של טחינה או עיכול יגרמו לבידוד לקוי של אדיפוציטים.
הכנה ועיכול נכונים של רקמת השומן יביאו להפרדת הרקמה לארבע שכבות נפרדות, כפי שניתן לראות באיור 3. התפרצות מסוימת של השומנים וכתוצאה מכך שחרור שומנים חופשיים היא בלתי נמנעת; עם זאת, טחינה ועיכול נאותים יבטיחו קרע מינימלי בשומן. שכבת השומנים החופשית הנותרת והמדיה יוסרו במהלך אריזת השומנים החופשיים (איור 4). אריזה נכונה של האדיפוציטים חיונית לבידוד יעיל של אדיפוציטים בוגרים. כל השומנים או המדיה החופשיים שנותרו יגרמו לבידוד לקוי וישפיעו לרעה על מבחנים תפקודיים במורד הזרם, כגון ציפוי, ליפוליזה והדמיית תאים.
פרוטוקול זה מייצר הכנה נקייה של אדיפוציטים בוגרים. ניתן לבצע הדמיית תאים ובדיקות ליפוליזה כדי להעריך את תפקוד התאים ולהוכיח כי האדיפוציטים הבוגרים שומרים על תפקודם לאחר הבידוד ולאחר תרבית עד שבועיים. בדיקת הליפוליזה מצביעה על כך שהשומנים הבוגרים שומרים על היכולת להגיב לאיתות תאי באמצעות שחרור גליצרול חופשי עם גירוי הקולטן האדרנרגי β-3 (איור 6A,B). יכולת זו נשמרת גם לאחר שבועיים בתרבית והיא דומה מאוד לפעילות הליפוליזה של צמחי רקמת שומן שגודלו במשך 24 שעות (איור 6C,D). אדיפוציטים באיכות ירודה יראו ליפוליזה מוחלשת. הדמיית התאים של אדיפוציטים מבודדים מראה אדיפוציטים בוגרים חד-עיניים עגולים ושלמים המכילים טיפת שומן אחת גדולה. בידוד אדיפוציטים באיכות ירודה יציג בעיקר טיפות שמן גדולות חוץ-תאיות המעידות על אדיפוציטים מתפרצים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig01.jpg"> 
איור 1: הטמעה של צמחי רקמת שומן. (A) תמונה של כיפת מטריצת קרום הבסיס שהתמצקה חלקית לפני הטמעת הרקמה. (ב) תמונות מייצגות של הטמעת רקמות לא נכונה ותקינה. הטבעה לא נכונה נראית כאשר הרקמה נראית צפה חלקית או מלאה מעל הכיפה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig02.jpg"> 
איור 2: סכימה של טחינה ועיכול תקינים של רקמת השומן. (A) ייצוג סכמטי של שלבי טחינת רקמות ועיכול 4.2-4.6. (B) תמונות מייצגות של רקמה תחתונה, אופטימלית וטחונה יתר על המידה. ברקמה מתחת לטחון יש נתחים גדולים השומרים על צורתם המקורית. רקמה טחונה יתר גורמת לעלייה ניכרת בשומנים החופשיים המקיפים את הרקמה, שנראים צלולים ושומניים. (C) תמונות מייצגות של רקמות תת-קרקעיות, אופטימליות ומעוכלות יתר על המידה. רקמה לא מעוכלת מכילה גושי רקמה שלמה שנותרו בתמיסה. רקמה מעוכלת יתר מציגה שכבת שומנים חופשית גדולה הנפרדת במהירות מהתמיסה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig03.jpg"> 
איור 3: הפרדת שכבות של רקמת שומן מעוכלת. (A) תמונה סכמטית ומייצגת של השכבות הקיימות לאחר שלב 5.3. (B) שימוש בקצה פיפטה חתוך כדי להסיר את שכבת השומן הבוגרת מהצינור החרוטי של 50 מ"ל. (ג) טכניקה ומיקום נכונים של המחט והמזרק כדי להסיר את מצע התרבית מתחת לשכבת השומן הבוגרת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig04.jpg"> 
איור 4: אריזה רציפה של אדיפוציטים בוגרים. תמונות עוקבות של אריזת השומנים הבוגרים. שכבות של ליפידים חופשיים, אדיפוציטים ומדיה מסומנות. לאחר כל סיבוב, מסירים שומנים ומדיה חופשיים. זה חוזר על עצמו עד שלא נפרדים מדיה או שומנים חופשיים מהאדיפוציטים לאחר סיבוב. התמונה הסופית מייצגת אדיפוציטים בוגרים ארוזים היטב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig05.jpg"> 
איור 5: ציפוי ותרבות של אדיפוציטים בוגרים. (A) סכמטי של הציפוי של אדיפוציטים בוגרים. בעזרת קצה פיפטה p200 חתוך, אדיפוציטים ארוזים מונחים על הממברנה של תוספת תרבית תאים. לאחר מכן התוספת הופכת לבארות מלאות מראש של אמצעי תרבית. (B) תמונה מייצגת של ציפוי אדיפוציטים בוגרים המתארים קצה פיפטה חתוך המפקיד אדיפוציטים על הכנסת טרנסוול. (C) סכמות ותמונות מייצגות של אדיפוציטים ארוזים כהלכה וארוזים בצורה גרועה מצופים בטרנסוולים, כפי שניתן לראות מעל הבארות. אדיפוציטים ארוזים כהלכה נראים לבנים ואטומים, בעוד שאדיפוציטים ארוזים בצורה גרועה גורמים להיווצרות טיפות שומנים שקופות. (D) סכמטי של הטכניקה המשמשת לשינוי מדיית התרבית. קצה פיפטה p200 משמש להסרה זהירה של המדיה דרך הפתחים בדופן הצדדית של תוספת הטרנסוול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig06.jpg"> 
איור 6: הדמיה של אדיפוציטים בוגרים ובדיקת ליפוליזה. (א,ב) שחרור גליצרול מתיפוציטים בוגרים תת-עוריים (A) וקרביים (B). אדיפוציטים בודדו מעכברים זכרים בני 16 שבועות C57BL/6 שניזונו מתזונת צ'או רגילה. 30 מיקרוליטר של אדיפוציטים צופו כמתואר בשלב 7.1 ותרבו במשך 1 או 10 ימים. אדיפוציטים טופלו ב-5 מיקרומטר של CL-316,243 למשך שעה, שעתיים ו-4 שעות, וסופרנטנטים נאספו ונותחו לגליצרול חופשי. (ג,ד) שחרור גליצרול מצמחי רקמת שומן תת עורית (C) וקרביים (D). רקמת השומן בודדה מעכברים נקבות C57BL/6 בנות 18 שבועות שהוזנו בדיאטת צ'או רגילה. 0.1 גרם של רקמת שומן צופו כמתואר בשלבים 3.1-3.4 ותרבו במשך 24 שעות. אדיפוציטים טופלו ב-5 מיקרומטר של CL-316,243 למשך שעה, שעתיים ו-4 שעות, וסופרנטנטים נאספו ונותחו לגליצרול חופשי. N = 3 שכפולים טכניים עבור A-D. כל הנתונים הם ממוצע ± סטיית תקן. (E) תמונות מייצגות של אדיפוציטים בוגרים תת-עוריים וקרביים מבודדים. אדיפוציטים בודדו מעכברים זכרים בני 16 שבועות C57BL/6J שהוזנו בדיאטת צ'או רגילה. אדיפוציטים נצבעו בכתם קרום פלזמה (אדום) וכתם גרעיני הוכסט (כחול). פסי קנה מידה: 50 מיקרומטר; הגדלה: פי 60. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>מין</td>
			<td>דיאטה</td>
			<td>דיפו</td>
			<td>קושי טחינה</td>
			<td>קולגנאז: יחס רקמות</td>
			<td>זמן עיכול מומלץ (דקות)</td>
			<td>טמפרטורת סחיטה.</td>
			<td>שטפו את הטמפרטורה.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">נקבה</td>
			<td rowspan="2">צ'או רגיל</td>
			<td>תת עורי</td>
			<td>קשה</td>
			<td>2:1</td>
			<td>12</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 מעלות צלזיוס</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>קרביים</td>
			<td>בינוני</td>
			<td>1:1</td>
			<td>8</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 מעלות צלזיוס</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">דיאטה עתירת שומן</td>
			<td>תת עורי</td>
			<td>קל</td>
			<td>1:1</td>
			<td>8</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 מעלות צלזיוס</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>קרביים</td>
			<td>קל</td>
			<td>1:1</td>
			<td>8</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 מעלות צלזיוס</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">זכר</td>
			<td rowspan="2">צ'או רגיל</td>
			<td>תת עורי</td>
			<td>קשה</td>
			<td>2:1</td>
			<td>14</td>
			<td>4 מעלות צלזיוס</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>קרביים</td>
			<td>בינוני</td>
			<td>1:1</td>
			<td>10</td>
			<td>4 מעלות צלזיוס</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">דיאטה עתירת שומן</td>
			<td>תת עורי</td>
			<td>קל</td>
			<td>1:1</td>
			<td>10</td>
			<td>4 מעלות צלזיוס</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>קרביים</td>
			<td>קל</td>
			<td>1:1</td>
			<td>10</td>
			<td>4 מעלות צלזיוס</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1: מין, מחסן ושינויים ספציפיים לתזונה. קושי הטחינה של כל רקמה, המתואר כ"קל", "בינוני" או "קשה" ביחס למחסנים אחרים. שימו לב שזמן הטחינה בפועל ישתנה בהתאם לחוקר ולרקמה. קולגנאז: יחס הרקמות הרשום כנפח (מ"ל) של תמיסת קולגנאז + DNase שהוכנה בשלב 4.1 למשקל הרקמה (גרם). זמן העיכול הוא הערכה משוערת, אך זמן העיכול בפועל ישתנה בהתאם לטחינה ולרקמה. חוקרים צריכים להעריך את העיכול כמתואר בפרוטוקול. טמפרטורת הסיבוב וטמפרטורת הכביסה שונות בין עכברים זכרים ונקבות. RT מציין את טמפרטורת החדר.

Adipose tissue is primarily composed of mature, lipid-laden adipocytes by volume. These postmitotic cells play a critical role in energy storage and ...

המחקר שלנו מתמקד בחקירת התפקוד של אדיפוציטים בוגרים ממאגרי שומן שונים ומצבים תזונתיים. אנו מתעניינים במיוחד בהבנת האופן שבו אדיפוציטים בוגרים מתקשרים עם התאים הסובבים, וכיצד הדיבור ההדדי הזה יכול להשפיע על התקדמות המחלה ולהשתנות בהשמנת יתר. אדיפוציטים בוגרים הם תאים גדולים ועדינים, מה שהופך את שיטות בידוד התאים הנפוצות כגון FACS ללא יעילות.יתר על כן, רמות גבוהות של שומנים חופשיים הנמצאים לעתים קרובות ברקמת השומן עלולות להיות רעילות לאדיפוציטים בוגרים ולסבך את תחזוקתם. בניגוד לשיטות נפוצות המסתמכות על התמיינות במבחנה של פרה-אדיפוציטים, פרוטוקול זה מאפשר לנו לחקור אדיפוציטים מבודדים ex vivo, שהם דומים מבחינה תפקודית ושעתוק לאדיפוציטים in vivo. זה חשוב במיוחד מכיוון שאדיפוציטים משתנים מאוד בין מצבורי שומן ובתנאי תזונה שונים.פרוטוקול זה מבודד ביעילות, משקף אדיפוציטים בוגרים וניתן להרחבה בקלות. התאמות כלולות כדי לייעל את הבידוד של אדיפוציטים מעכברים ממינים שונים ועם תנאים תזונתיים שונים. לאחר הבידוד, ניתן לתרבת, לדמות או להשתמש בכל דרך אחרת לפי הצורך.כדי להתחיל, הכינו תמיסת קולגנאז עם DNase על ידי הוספת 0.00017 גרם DNase למיליליטר אחד של תמיסת קולגנאז, ומערבלו את התערובת כדי להבטיח ערבוב מלא. בעזרת סכין גילוח, טוחנים את רקמת השומן של העכברים המבודדים עד שהיא נראית הומוגנית. לאחר מכן העבירו את רקמת הטחון לצינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר.הוסף את תמיסת הקולגנאז וה-DNase המוכנה לרקמת השומן הטחונה והמערבולת במהירות מקסימלית למשך שבע עד 10 שניות כדי לערבב היטב את הרכיבים. לאחר מכן הנח את הצינורות החרוטיים של 50 מיליליטר אופקית בשייקר המוגדר ל-220 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר הדגירה, הסר את הצינורות, מערבולת למשך חמש שניות ובדוק את הדגימות.כעת באמצעות פיפטה סרולוגית, העבירו את הרקמה המעוכלת דרך מסננת לצינור חרוטי סטרילי חדש של 50 מיליליטר. הוסף FBS השווה לנפח הרקמה ותמיסת הקולגנאז דרך המסננת לאותו צינור חרוטי כדי לנטרל את הקולגנאז. סובב את הצינורות בחום של 300 גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורה המצוינת בטבלה המוצגת כאן.לאחר מכן בעזרת פיפטה של 200 מיקרוליטר, השליכו בזהירות את השכבה העליונה של השומנים החופשיים. לאחר מכן, השתמש בפיפטה P1000 כשהקצה מנותק כדי להעביר את האדיפוציטים הבוגרים לצינור מוכן של 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של אמצעי גידול. הפוך בעדינות את הצינורות של 15 מיליליטר המכילים אדיפוציטים בוגרים שלוש עד חמש פעמים עד שהשכבה הלבנה מתפזרת בכל המדיה.לאחר הנחת הצינורות למשך 10 דקות, סובב אותם בטמפרטורה שנקבעה בעבר כדי להפריד עוד יותר את השכבות. לאחר מכן, השתמש בפיפטה כדי להשליך את השכבה העליונה של השומנים החופשיים. כעת חבר מחט בגודל 21 למזרק של חמישה מיליליטר והחלק בזהירות את המחט במורד קצה הצינור עד שתחתית המחט נמצאת מתחת לשכבת אתר השומן הבוגר.לאחר מכן משוך לאט את המזרק כדי להסיר את אמצעי התרבות וכל פסולת סלולרית. הוסף בעדינות 10 מיליליטר של אמצעי תרבות לצינור. באמצעות קצות פיפטה לטעינת ג'ל החלק את הקצה במורד קצה הצינור כדי להסיר את המדיה שנותרה מתחת לשכבת השומן הבוגרת.ואז צנטריפוגה את התאים ב 100 גרם למשך דקה אחת. בעזרת פיפטה הסר את השומנים החופשיים. בעזרת קצה פיפטה לטעינת ג'ל הסר את אמצעי התרבית מתחת לאדיפוציטים.הסר את תוספות תרבית התאים מצלחת 24 בארות שטופלה בתרבית רקמות והנח אותן עם הממברנה כלפי מעלה על פני מכסה המנוע. מלאו בארות לסירוגין של הצלחת באמצעי תרבות חם. בעזרת קצה פיפטה P200 חתוך, העבירו 30 מיקרוליטר של אדיפוציטים בוגרים ארוזים על החלק העליון של תוספת Transwell.לאחר מכן הרם בזהירות את תוספת הטרנסוול, הפוך אותה והניח אותה לבאר ממולאת מראש בצלחת 24 הבארות. כדי להוציא את המדיה מהבארות, החזיקו את ה-Transwell יציב ושאבו עם פיפטה P200 דרך הפתחים הקטנים בצדדים. לאחר הסרת המדיה, תוך כדי החזקת ה-Transwell במקומו, הוסיפו לאט מיליליטר אחד של מדיה טרייה לאורך דופן הבאר.

isolation-culturing-primary-murine-adipocytes-from-lean-obese

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בשל קשר דרסטי והשלילי בין השמנת יתר ומחלות רקע אחרים, מחקר על תפקיד השומן משחק במחלה ועל בריאות כללית היא מוצדקת. אנו מציגים פרוטוקול לבידוד והכריתה של מחסני שומן ומאפשרים לחקר השומן באמצעות באתר ובשיטות חוץ גופית.

לוקליזציה, זיהוי, וכריתה של בסיס מיון Murine שומן

התרבות צבירה בוגרת של הממברנה (MAAC) היא שיטה חדשה לתרבות adipocytes האדם בוגרת. כאן אנו מפרטים כיצד לבודד adipocytes מן האדיפוז האנושית וכיצד להגדיר MAAC.

בידוד ותרבות של האדם Adipocytes בוגרים באמצעות ממברנה מבוגרים תרבויות הצבירה (MAAC)

פרוטוקול זה מתאר את הגישה הטכנית לבידוד תת-אוכלוסיות תאי סטרומה אדיפוגניים ופיברו-דלקתיים ממחסני רקמת שומן לבן תוך בטני (WAT) על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות או הפרדת חרוזים אימונומגנטית.

בידוד תת-אוכלוסיות תאי סטרומה אדיפוגניים ופיברו-דלקתיים ממחסני שומן תוך-בטניים של מורין

דו"ח זה מתאר פרוטוקול לבידוד בו זמנית של preadipocytes חום ולבן ראשוני מעכברים שזה עתה נולדו. תאים מבודדים ניתן לגדל בתרבות המושרה להבדיל לתוך adipocytes לבן וחום בוגר לחלוטין. השיטה מאפשרת אפיון גנטי, מולקולרי ותפקודי של תאי שומן ראשוניים בתרבות.

בידוד ובידול של Preadipocytes לבן וחום ראשוני מעכברים שזה עתה נולדו

מחקר זה מתאר שיטה חדשה לבידוד אדיפוציטים חומים מורין לניתוח ביטוי גנים וחלבונים.

בידוד אדיפוציטים חומים מרקמת שומן חום אינטרסקפולרית של מורין לניתוח ביטוי גנים וחלבונים

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של קדם-אדיפוציטים של עכברים משומן תת-עורי, התמיינותם לאדיפוציטים בוגרים והשראת תנגודת לאינסולין. פעולת האינסולין מוערכת על ידי זרחון / הפעלה של חברי מסלול איתות האינסולין דרך כתם מערבי. שיטה זו מאפשרת קביעה ישירה של תנגודת/רגישות לאינסולין באדיפוציטים ראשוניים.

אדיפוציטים מובחנים של עכברים בתרבית ראשונית: מודל של תנגודת לאינסולין

במאמר זה אנו מתארים את הבידוד, התרבית והאינדוקציה האידיפוגנית של קדם-אדיפוציטים שמקורם בשברי כלי דם סטרומה מרקמת השומן הפריאו-אורטית של עכבר, מה שמאפשר לחקור את תפקוד רקמת השומן הפריווסקולרית ואת הקשר שלה עם תאי כלי הדם.

בידוד, תרבית ואינדוקציה אדיפוגנית של פרדיפוציטים שמקורם בשבר כלי דם סטרומה מרקמת שומן פריאורטית של עכבר

באמצעות מודל ex vivo ex vivo ex plant, חתיכות קטנות מהחלק הרוסטרלי של רקמת השומן הלבנה הוויסרלית מעכברים רזים מתרבות במשך 7–10 ימים, מה שמאפשר השראה ומחקר של דלקת רקמת השומן כפי שהיא מתרחשת במהלך האכלה עתירה שומן.

מודל עכבר אקס ויבו לדלקת רקמת שומן בדיאטה עתירה שומן

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבידוד והתרבות של Murine לתאי אנדותל ריאתי. שיטה זו כוללת מכונאי דיסוציאציה האנזימטית רקמת הריאות, כמו גם תהליך צעד 2-טיהור באמצעות אנטי PECAM-1 ואנטי ICAM-2 נוגדנים מצומדות כדי חרוזים מגנטיים, אשר מייצר אוכלוסיה טהור תא האנדותל של כלי הדם בעיקר מקור.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

בדו"ח זה, אנו מתארים פרוטוקול בידוד אוכלוסיות מטוהרים מאוד של leukocytes כי החודרים גידולים. פרוטוקול זה הוא עיבוד ביוטק Miltenyi בפרוטוקול כדי לשפר את התשואה וטוהר לבידוד תאים של רקמת הגידול מורכב.

בידוד של תאים חיסוניים של גידולים ראשוניים

למדו פרוטוקול לבידוד אדיפוציטים בוגרים מרקמות שומן שונות בעכברים תחת תנאי תזונה שונים. השיטה מאפשרת ניתוח תפקודי של תאים עדינים לחקר השמנת והמטבוליזם.

בידוד ותרבות של אדיפוציטים עכבריים ראשוניים מעכברים רזים והשמנים

גלה סרטונים נוספים