גידול וקטיף חד-שבטי מיקרוביאלי אוטומטי ובתפוקה גבוהה באמצעות מערכת אומיקס תרבית מיקרוליטר-טיפה חד-תאית
14 במרץ 2025
פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במערכת Omics של תרבית מיקרוליטר טיפה חד-תאית (תא MISS) כדי לבצע בידוד, טיפוח וקטיף חד-שבטי מיקרוביאלי. תא ה-MISS משיג זרימת עבודה משולבת המבוססת על טכנולוגיית מיקרופלואידית טיפות, המציעה פיזור חד-טיפתי מעולה, גידול מקביל גבוה וזיהוי ביומסה בתפוקה גבוהה.
מחקר זה בוחן אומיקס של תרבית מיקרוביאלית, תוך שימוש בפלטפורמה אוטומטית, כדי לשפר את הבידוד, הגידול וההקרנה החד-שבטית. המטרה היא לשפר את ההבנה של המעיים האנושיים, המיקרוביום והיישומים שלהם. טכנולוגים המקדמים את מחקר המיקרוביום כוללים טיפת מיקרופלואידיקה, פלטפורמות בידוד וסינון אוטומטיות, אלגוריתמים של למידת מכונה ומתקנים חד-שבטיים לאומיקס תרבית מתח גבוה וניתוח מיקרוביום.
מערכת התאים האמצעית משפרת משמעותית את המיקרו-ראייה, הבידוד החד-שבטי והצביעה, ויוצרת כמעט כפול של שיבוטים בהשוואה לשיטות מסורתיות, ובכך מקדמת את יכולת המחקר בתמהיל תרביות מיקרו-מבט במעיים. פרוטוקול זה עונה על הצורך בפלטפורמת סינון מיקרוביאלית בעלות נמוכה עם תמיכה גבוהה, תוך התגברות על מגבלות השיטות המסורתיות ביעילות ויכולת ניקוד עבור מחקר תמהיל תרביות. המעבדה שלנו תתמקד עוד בשילוב של טכניקות נוספות למניפולציה של טיפות, כגון פיצול טיפות ומיזוג כדי להרחיב את היקף היישומים הטכנולוגיים.
כדי להתחיל, פתח את דלת תא הייצור והטיפוח של תא ה-MISS. הסר אנכית את כיסוי המגן עבור השבב המיקרו-נוזלי ליצירת המיקרו-צינורות והטיפות. בעזרת מזרק חד פעמי, הוסף 10 מיליליטר מים מזוקקים סטריליים למכשיר האדים בתוך התא והתקן מחדש את מכסה המגן.
פתח את האריזה הסטרילית של השבב המיקרו-נוזלי ליצירת המיקרו-צינורות והטיפות, והנח אותו אנכית ישירות מעל תא הטיפוח. לאחר מכן בממשק התוכנה, לחץ על התקנה. כאשר חלון האישור המוקפץ מופיע, לחץ על כן כדי להתחיל בהתקנה.
הוצא את מסיר בועות האוויר וקבע אותו הפוך על מיקום מסיר בועות האוויר בתא. חבר את צינור יציאת הטיפות של מסיר בועות האוויר ל-clampשסתום שמתחתיו. הנח אותו דרך כל המוביל לתא איתור ואיסוף הטיפות.
לאחר פתיחת דלת החדר, הכנס אנכית את צינור הזיהוי לשקע הזיהוי. ודא שצינור הזיהוי מוכנס במלואו. הדק את הבורג המאבטח את צינור הזיהוי בכיוון השעון.
לאחר אישור ההחדרה והאבטחה המלאה, סגור את דלת החדר. חבר כל אחד מ -10 צינורות הסיליקון מהשבב המיקרופלואידי, המסומן L1 עד L10, לשסתומי המהדק הממוספרים המתאימים להם. לאחר מכן, חבר את המחבר המהיר מהשבב המיקרופלואידי ליציאה המתאימה במערכת האומיקס, בעקבות חיבורים מתאימים.
לאחר השלמת התקנת השבב, מופיע חלון מוקפץ עם ההודעה, שסתום הידוק צינורות טיפות נפתח. לחץ על אישור כאשר התקנת השבב ליצירת צינורות מיקרו וטיפות תושלם. לאחר שווידאתם שכל הצינורות מחוברים כהלכה לשסתומי המהדק המתאימים להם, לחץ על אישור.
לפני ביצוע האתחול, לחץ על ממשק ההגדרה כדי להגדיר את הפרמטרים הרלוונטיים, כמו מצב סלקטיבי, טמפרטורת הדגירה, זמן הדגירה, מהירות התסיסה, אורך גל זיהוי OD ואורך גל עירור ופליטה לזיהוי פלואורסצנטי. נווט לממשק הבית ולחץ על אתחול. חלון האישור המוקפץ מופיע לחץ על כן כדי לאפשר למערכת ה-IC לבצע בדיקה עצמית של רכיביה, כולל משאבת ההזרקה, הגדרות הטמפרטורה, בדיקת פריקת נוזלי פסולת, מודול סינון ומודול זיהוי טיפות.
לאחר השלמת האתחול, לחץ על אישור מהחלון המוקפץ. כדי להכין את הדגימה, קח את הדגימה המיקרוביאלית ובצע דילול סדרתי עם המדיום המתאים כדי להשיג ריכוז של כ-50 תאים למיליליטר כדי לקבל תרחיף דגימה של 40 מיליליטר. לאחר מכן הברג את המכסה של בקבוק הדגימה ושפך את תרחיף הצואה המדולל לתוך הבקבוק בעזרת מוט ערבוב מגנטי, עד למצב הוספת הדגימה.
הברג את המכסה והדק אותו היטב. לאחר מכן הכנס את המחבר המהיר A למחבר המהיר B כדי להשלים את תהליך טעינת הדגימה. לאחר הנחת בקבוק הדגימה למצב המיועד, הפרד את המחברים המהירים A ו-B מבקבוק הדגימה.
חבר את המחבר המהיר A של בקבוק הדגימה ליציאת O3 במערכת האומיץ'. חבר את מחבר C3 בשבב המיקרופלואידי למחבר מהיר B, וסגור את דלת החדר. בממשק הבית של התוכנה, בחר את המספר הרצוי של צינורות טיפות שייווצרו ולחץ על תוצרת כדי להתחיל ביצירת טיפות תא בודד.
המתן לחלון המוקפץ המציין את השלמת יצירת ה- droplet ולחץ על אישור. סגור את clamp על שלושת המחברים והסר את בקבוק הדגימה. בממשק הבית של התוכנה, בחר את אותו מספר צינורות טיפות המשמש במהלך יצירת טיפות.
תרבות קליקים. אשר את זמן הטיפוח והטמפרטורה, והתחל בתהליך. המתן לחלון המוקפץ, המציין את השלמת גידול הטיפות.
לחץ על כפתור ה-UV במערכת האומיק כדי להדליק אור אולטרה סגול. הקרין את תא זיהוי הטיפות והאיסוף למשך 30 דקות לפני כיבויו. בספסל נקי במיוחד, פתחו את כל 96 צלחות הבאר המשמשות לאיסוף טיפות, וערמו אותן זו על גבי זו ללא מכסים, ומספור אותן ברצף מלמטה למעלה.
ודא כי צלחת הבאר העליונה מכוסה במכסה. פתח את הדלת של תא זיהוי ואיסוף הטיפות, והנח את לוחות הבאר במיקומים המיועדים לכך. הסר את המכסה מצלחת הבאר העליונה ולאחר מכן סגור את דלת החדר.
הפעל שוב את נורית ה-UV במערכת האומיק למשך 30 דקות כדי לבצע עיקור משני. לאחר מכן, הסר את מסיר בועות האוויר ממצב המיקום שלו. הברג את המכסה והסר את הבורג בצורת פרפר מהכובע.
יוצקים 200 מיליליטר שמן להסרת בועות אוויר למסיר בועות האוויר. אבטח את המכסה בחוזקה, ולאחר מכן קבע את מסיר בועות האוויר הפוך במיקומו המיועד. בממשק הבית, בחר את צינור הטיפות למיון.
לחץ על מיון. הזן את מספר לוחות הבאר שיש לאסוף והתחל בתהליך המיון. שים לב לאזור תצוגת התהליך למדידות בזמן אמת של צפיפות אופטית של טיפות או ערכי פלואורסצנטיות.
נתח כ-20 עד 30 טיפות כדי לבדוק את ערך ה-OD. אם לרוב הטיפות יש OD של כ-0.2, הגדר את סף ה-OD התחתון ל-0.5 ואת סף ה-OD העליון לארבע. המערכת תאסוף אוטומטית טיפות בטווח זה לתוך 96 לוחות הבארות.
המתן לחלון המוקפץ המציין את השלמת המיון והאיסוף של droplet ולאחר מכן לחץ על אישור. פתח את דלת תא זיהוי ואיסוף הטיפות. מניחים את מכסה צלחת הבאר על צלחת הבאר העליונה, ומסירים את הצלחות יחד.
לחץ על ייצוא נתונים כדי לשמור את נתוני אות הטיפות שנאספו. לחץ על מפת חום. בחר את קובץ הנתונים של איסוף הטיפות וצפה ב-OD המוצג בפורמט המיקרו-לוח.
דמיין את ערכי ה-OD הללו כמפת חום שבה עוצמת הצבע תואמת את התפלגות ה-OD על פני הבארות, ומספק ייצוג ברור ואינטואיטיבי. מגוון המינים של מיקרוביוטת המעיים האנושית שהתקבלה מהמערכת האומית, שיטת הצלחת המוצקה ודגימת הצואה הראשונית הושוו ברמת המשפחה. 34 משפחות מיקרוביאליות הועשרו הן בשיטת הלוח המוצק והן בשיטת האומיקס המודגמת, כאשר המערכת האומית העשירה בנוסף ארבע משפחות.
המערכת האומית גם העשירה ביעילות חלק ממשפחות השפע הנמוך. ברמת הסוג, שתי השיטות העשירו 74 סוגים מיקרוביאליים, בעוד ששיטת התאים MISS העשירה בנוסף 13 סוגים. יתר על כן, שני סוגים שהיו בתחילה בשפע נמוך הועשרו ביעילות, באמצעות מערכת OMIC.
תוצאות אלו הראו כי שיטת תרבית התאים MISS סיפקה תנאי גידול טובים יותר לאותם זנים שהיו נוכחים בפרופורציות נמוכות או שהיו בעלי ביצועי גדילה גרועים בתרחיף המיקרוביאלי המקורי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את השימוש במערכת תרבית טיפת מיקרוליטר חד-תאית (תא MISS) לבידוד ותרבית חד-שבטית מיקרוביאלית. המערכת משתמשת בטכנולוגיית מיקרו-נוזלים בטיפות כדי לשפר את היעילות והתפוקה במחקר מיקרוביאלי.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- תרבית מיקרוביאלית
- מיקרו-נוזלים
- מיון גבוה-תפוקתי
רקע
- המחקר מתמקד בשיפור טכניקות בידוד וגידול מיקרוביאלי.
- שיטות מסורתיות לעיתים קרובות חסרות יעילות ויכולת התרחבות.
- תא MISS מתמודד עם מגבלות אלו באמצעות טכנולוגיה מתקדמת.
- אומיקס של תרבית מיקרוביאלית חשוב להבנת המיקרוביום של מעי האדם.
מטרת המחקר
- לשפר את בידוד והמיון החד-שבטי של מיקרואורגניזמים.
- לשפר את ההבנה של מיקרוביום המעיים ויישומו.
- לספק פלטפורמה בעלת תמיכה גבוהה ומחיר נמוך למיון מיקרוביאלי.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- מערכת תרבית טיפת מיקרוליטר חד-תאית.
- טכנולוגיית מיקרו-נוזלים בטיפות לגידול מקבילי גבוה.
- פלטפורמות בידוד ומיון אוטומטי של זנים.
- אלגוריתמי למידת מכונה לניתוח נתונים.
תוצאות עיקריות
- תא MISS מגדיל באופן משמעותי את מספר השיבוטים שנוצרים בהשוואה לשיטות מסורתיות.
- שיפור היעילות בבידוד וגידול חד-שבטי מיקרוביאלי.
- הבנה משופרת של אינטראקציות מיקרוביאליות בתרבית.
- פוטנציאל להרחיב יישומים טכנולוגיים במחקר המיקרוביום.
מסקנות
- תא MISS מייצג התקדמות משמעותית בטכניקות תרבית מיקרוביאלית.
- הוא מתמודד עם מגבלות מרכזיות של שיטות מסורתיות.
- מחקר עתידי יתמקד בשילוב טכניקות נוספות למניפולציה של טיפות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
High-throughput, automated monoclonal microbial cultivation is critical for accelerating discovery in microbiome research and microbial culturomics. The MISS cell system enables rapid, scalable isolation and screening of diverse microbial strains, directly impacting early-stage target identification and functional validation. This capability supports portfolio expansion and de-risks translational microbiome programs by enabling access to previously uncultivable or low-abundance taxa.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of microbial diversity for target validation in microbiome-based therapeutics.
- Facilitates biological de-risking by isolating and characterizing low-abundance or fastidious strains.
- Supports predictive confidence in functional studies by providing pure monoclonal cultures.
Screening & Assay Development
- Prepares validated monoclonal cultures for downstream phenotypic screening and functional assays.
- Standardizes isolation and cultivation workflows, improving reproducibility and quantitative output.
- Enables high-throughput screening readiness and scalability for large microbial libraries.
Translational & Preclinical Research
- Expands access to disease-relevant microbial taxa for translational biomarker discovery.
- Improves continuity from discovery to preclinical validation by enabling robust strain selection.
- Supports risk-adjusted advancement of microbiome-based candidates by enriching for functional diversity.
Pipeline & Workflow Integration
The MISS cell system integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early microbial isolation with downstream functional and translational studies.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and pathway clarification by enabling rapid monoclonal isolation.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers optical density and fluorescence-based measurements for robust comparison of microbial growth conditions.
- Translational Research: Aligns with biomarker and disease-relevant taxa enrichment for preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, automated platform for repeated use across diverse microbial projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microbiome research.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable monoclonal cultivation workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by expanding accessible microbial diversity.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of microbiome-based assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, microbial handling, and data analysis.
- Needs specialized instrumentation for droplet generation, detection, and sorting.
- Demands cross-team standardization for data comparability and workflow integration.
- Adaptation may be needed for different microbial communities or sample types.
- Throughput and diversity gains depend on sample preparation and system calibration.
