זרימת עבודה אופטימלית להלבנה איטרטיבית מרחיבה את ההדמיה המרובה של דגימות קליניות אוטו-פלואורסצנטיות מאוד

[קריין] באמצעות פרוטאומיקה מרחבית, המכונה שיטת השנה של Nature Methods לשנת 2024, ניתן למפות את המיקומים המדויקים של תאי החיסון יחד עם אינטראקציות תא-תא בתוך רקמות. זה חושף דפוסים מרחביים הקשורים לתוצאות קליניות. בניית לוחות נוגדנים מורכבים ורקמות הדמיה עם פלואורסצנטיות אנדוגנית גבוהה מהווים אתגרי זמן, משאבים ומומחיות משמעותיים עבור IBEX וטכניקות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות אחרות. באמצעות IBEX, זוהו מאפיינים ספציפיים לגידול בחולי לימפומה זקיקית בסיכון גבוה, ועם עמיתים באטלס התאים האנושיים. נוצרה מפה מרחבית מקיפה של בלוטת התימוס האנושית. מעט ידוע על הרכב תאי החיסון, האינטראקציות המרחביות והבדלי ייצור הציטוקינים על פני פתולוגיות ריאתיות מיקובקטריאליות מגוונות. פרוטוקול זה מגשר על הפער הזה. פרוטוקול זה מציע שיטת הקרנת אור בעלות נמוכה וניתנת להתאמה להפחתה משמעותית של אוטופלואורסצנציה של רקמות בספקטרום רחב, במיוחד בדגימות FFPE קשות, תוך שמירה על אות הנוגדנים לניתוח מרחבי. כדי להתחיל, טבלו את השקופיות עם רקמה ב-PBS לאחר השלמת אחזור האנטיגן. הסר שקופית אחת מה-PBS והשתמש במגבון נטול מוך כדי לייבש בזהירות את כל המאגר העודף מבלי לגעת ברקמה. בעזרת עט הידרופובי, צייר גבול סביב קטע הרקמה בשקופית. לאחר חזרה על התהליך עבור המגלשות הנותרות, הניחו למחסומים ההידרופוביים להתייבש למשך 10 דקות. לאחר מכן, בעזרת מגבון נטול מוך, נדפו את ה-PBS מחלק הרקמה מבלי לגעת ישירות ברקמה. כעת הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר חוסם על השקופית וסגור את תא הלחות. הנח את החדר במיקרוגל מדעי שאינו מחמם עם מנגנון ויסות טמפרטורה והפעל את התוכנית שהוקמה קודם לכן חמישה מחזורים. במהלך הדגירה החוסמת, הכינו את תמיסת צביעת הנוגדנים העיקרית 1 עם ווים והמאגר החוסם המכיל בלוק Fc. שלב את הנוגדנים וערבב בעדינות את הקוקטייל. בסיום מחזור המיקרוגל, הסר ופתח את תא ההחלקה ונתף את המאגר החוסם מהמגלשה מבלי לגעת ברקמה. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת צביעת נוגדנים ראשונית 1 לשקופית. החזר את התא למיקרוגל והפעל שוב את תוכנית הנוגדנים העיקרית למשך כ-30 דקות. לאחר השלמת תיוג הנוגדנים הראשוני, החזק את השקופית בצורה אנכית. כדי לשטוף את המגלשה, פיפטה 1,000 מיקרוליטר PBS על הרקמה, ואפשרה לה לברוח. הסר את עודפי ה- PBS ותקן את השקופית עם 1% פרפורמלדהיד למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בתא הלחות. לאחר הקיבוע, שטפו את השקופית היטב עם 1,000 מיקרוליטר PBS שלוש עד חמש פעמים והשאירו שכבה של PBS על הרקמה עד לשלב ההקרנה. להכנת קופסת הקרנת האור, אספו מנורת לד של 150 וואט, מנורת LED הצפה RGBW של 40 וואט, מיכל פלסטיק גדול בנפח 75.71 ליטר ומעלה, PBS טרי וצלחת פטרי. כעת מלאו את צלחת הפטרי ב-1x PBS כדי להטביע לחלוטין את המגלשה. בצע את הליך הקרנת האור בחדר קר כדי למזער את החום מהמנורות. לאחר מכן הניחו את השקופית בצלחת הפטרי, וודאו שהיא שקועה במלואה ב-PBS. לאחר מכן, הנח את ה-40 וואט lamp ישירות מעל צלחת הפטרי כשמקור האור פונה כלפי מטה לכיוון המגלשה והגדר את המנורה למצב אור אדום. לבסוף, הפעל את מנורות ה-150 וואט וה-40 וואט וכסה את כל ההתקנה במכסה מיכל הפלסטיק. לאחר שעתיים, העבר את המנורה לאור ירוק ודגר למשך 16 שעות. הפלואורופורים הבהירים ביותר התואמים לפרוטוקול השבתת הצבע זוהו והוצמדו לסמנים בעלי ביטוי נמוך כדי לשפר את זיהוי האותות. האוטופלואורסצנציה הופחתה באופן משמעותי לאחר הקרנת אור, ובאורכי גל הדמיה ארוכים יותר. נוגדנים מצומדים ישירות המכוונים לסמנים מבניים בעלי ביטוי גבוה, אקטין שריר חלק אלפא ופאן ציטוקרטין, שהוחלפו בתעלת האינפרא אדום הקרובה ב-750 ננומטר. אות הרקע הופחת באופן חישובי באמצעות תמונת ייחוס לא מוכתמת ואריתמטיקה של SimpleITK, ואותות אמיתיים שופרו באמצעות סף. הדמיית שקופיות שלמה של קטעים מוכתמים ב-IBEX חשפה גרנולומות עם ליבות נמקיות ונויטרופילים חיוביים ל-CD15. מיקובקטריום טוברקולוזיס או מיקובקטריות שאינן שחפתיות זוהו ליד הליבה הנמקית של הגרנולומה באמצעות נוגדן אנטי-אנטיגן 85B. רקמת לימפה הקשורה לגרנולומה הכילה תאי B חיוביים ל-CD20, תאי T חיוביים ל-CD4, כמה תאי T חיוביים ל-CD8 ותיוג CD45 של כל תאי החיסון בריאה. הדמיית IBEX אפשרה גם הדמיה של מאפיינים אנטומיים של הריאות, כולל תאי אפיתל של הסימפונות, שריר חלק עורקי ומקרופאגים חיוביים ל-CD68.