זרימת עבודה אופטימלית להלבנה איטרטיבית מרחיבה את ההדמיה המרובה של דגימות קליניות אוטו-פלואורסצנטיות מאוד
11 ביולי 2025
היישום של טכניקת הקרנה פוטו-ארבלית בעלות נמוכה בשיטת IBEX הידנית מאפשר הדמיה אופטימלית של רקמות אנושיות עם אוטופלואורסצנציה טבעית משמעותית. פרוטוקול זה מפרט כיצד להשיג תמונות מרובות ושקופיות שלמות מדגימות קליניות בארכיון באמצעות מיקרוסקופ הפוך, ריאגנטים זמינים באופן נרחב ותוכנת קוד פתוח ליישור ועיבוד תמונה.
[קריין] באמצעות פרוטאומיקה מרחבית, המכונה שיטת השנה של Nature Methods לשנת 2024, ניתן למפות את המיקומים המדויקים של תאי החיסון יחד עם אינטראקציות תא-תא בתוך רקמות. זה חושף דפוסים מרחביים הקשורים לתוצאות קליניות. בניית לוחות נוגדנים מורכבים ורקמות הדמיה עם פלואורסצנטיות אנדוגנית גבוהה מהווים אתגרי זמן, משאבים ומומחיות משמעותיים עבור IBEX וטכניקות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות אחרות. באמצעות IBEX, זוהו מאפיינים ספציפיים לגידול בחולי לימפומה זקיקית בסיכון גבוה, ועם עמיתים באטלס התאים האנושיים. נוצרה מפה מרחבית מקיפה של בלוטת התימוס האנושית. מעט ידוע על הרכב תאי החיסון, האינטראקציות המרחביות והבדלי ייצור הציטוקינים על פני פתולוגיות ריאתיות מיקובקטריאליות מגוונות. פרוטוקול זה מגשר על הפער הזה. פרוטוקול זה מציע שיטת הקרנת אור בעלות נמוכה וניתנת להתאמה להפחתה משמעותית של אוטופלואורסצנציה של רקמות בספקטרום רחב, במיוחד בדגימות FFPE קשות, תוך שמירה על אות הנוגדנים לניתוח מרחבי. כדי להתחיל, טבלו את השקופיות עם רקמה ב-PBS לאחר השלמת אחזור האנטיגן. הסר שקופית אחת מה-PBS והשתמש במגבון נטול מוך כדי לייבש בזהירות את כל המאגר העודף מבלי לגעת ברקמה. בעזרת עט הידרופובי, צייר גבול סביב קטע הרקמה בשקופית. לאחר חזרה על התהליך עבור המגלשות הנותרות, הניחו למחסומים ההידרופוביים להתייבש למשך 10 דקות. לאחר מכן, בעזרת מגבון נטול מוך, נדפו את ה-PBS מחלק הרקמה מבלי לגעת ישירות ברקמה. כעת הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר חוסם על השקופית וסגור את תא הלחות. הנח את החדר במיקרוגל מדעי שאינו מחמם עם מנגנון ויסות טמפרטורה והפעל את התוכנית שהוקמה קודם לכן חמישה מחזורים. במהלך הדגירה החוסמת, הכינו את תמיסת צביעת הנוגדנים העיקרית 1 עם ווים והמאגר החוסם המכיל בלוק Fc. שלב את הנוגדנים וערבב בעדינות את הקוקטייל. בסיום מחזור המיקרוגל, הסר ופתח את תא ההחלקה ונתף את המאגר החוסם מהמגלשה מבלי לגעת ברקמה. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת צביעת נוגדנים ראשונית 1 לשקופית. החזר את התא למיקרוגל והפעל שוב את תוכנית הנוגדנים העיקרית למשך כ-30 דקות. לאחר השלמת תיוג הנוגדנים הראשוני, החזק את השקופית בצורה אנכית. כדי לשטוף את המגלשה, פיפטה 1,000 מיקרוליטר PBS על הרקמה, ואפשרה לה לברוח. הסר את עודפי ה- PBS ותקן את השקופית עם 1% פרפורמלדהיד למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בתא הלחות. לאחר הקיבוע, שטפו את השקופית היטב עם 1,000 מיקרוליטר PBS שלוש עד חמש פעמים והשאירו שכבה של PBS על הרקמה עד לשלב ההקרנה. להכנת קופסת הקרנת האור, אספו מנורת לד של 150 וואט, מנורת LED הצפה RGBW של 40 וואט, מיכל פלסטיק גדול בנפח 75.71 ליטר ומעלה, PBS טרי וצלחת פטרי. כעת מלאו את צלחת הפטרי ב-1x PBS כדי להטביע לחלוטין את המגלשה. בצע את הליך הקרנת האור בחדר קר כדי למזער את החום מהמנורות. לאחר מכן הניחו את השקופית בצלחת הפטרי, וודאו שהיא שקועה במלואה ב-PBS. לאחר מכן, הנח את ה-40 וואט lamp ישירות מעל צלחת הפטרי כשמקור האור פונה כלפי מטה לכיוון המגלשה והגדר את המנורה למצב אור אדום. לבסוף, הפעל את מנורות ה-150 וואט וה-40 וואט וכסה את כל ההתקנה במכסה מיכל הפלסטיק. לאחר שעתיים, העבר את המנורה לאור ירוק ודגר למשך 16 שעות. הפלואורופורים הבהירים ביותר התואמים לפרוטוקול השבתת הצבע זוהו והוצמדו לסמנים בעלי ביטוי נמוך כדי לשפר את זיהוי האותות. האוטופלואורסצנציה הופחתה באופן משמעותי לאחר הקרנת אור, ובאורכי גל הדמיה ארוכים יותר. נוגדנים מצומדים ישירות המכוונים לסמנים מבניים בעלי ביטוי גבוה, אקטין שריר חלק אלפא ופאן ציטוקרטין, שהוחלפו בתעלת האינפרא אדום הקרובה ב-750 ננומטר. אות הרקע הופחת באופן חישובי באמצעות תמונת ייחוס לא מוכתמת ואריתמטיקה של SimpleITK, ואותות אמיתיים שופרו באמצעות סף. הדמיית שקופיות שלמה של קטעים מוכתמים ב-IBEX חשפה גרנולומות עם ליבות נמקיות ונויטרופילים חיוביים ל-CD15. מיקובקטריום טוברקולוזיס או מיקובקטריות שאינן שחפתיות זוהו ליד הליבה הנמקית של הגרנולומה באמצעות נוגדן אנטי-אנטיגן 85B. רקמת לימפה הקשורה לגרנולומה הכילה תאי B חיוביים ל-CD20, תאי T חיוביים ל-CD4, כמה תאי T חיוביים ל-CD8 ותיוג CD45 של כל תאי החיסון בריאה. הדמיית IBEX אפשרה גם הדמיה של מאפיינים אנטומיים של הריאות, כולל תאי אפיתל של הסימפונות, שריר חלק עורקי ומקרופאגים חיוביים ל-CD68.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מציג טכניקת פוטו-הקרנה בעלות נמוכה המשפרת את ההדמיה של רקמות אנושיות עם אוטו-פלואורסנציה טבעית. הפרוטוקול מאפשר הדמיה של רקמות שלמות מרובות מדגימות קליניות ארכיוניות באמצעות חומרים זמינים באופן נרחב ותוכנה בקוד פתוח.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- נוירו-מדע
- אימונולוגיה
- מיקרוסקופיית פלואורסצנציה
רקע
- פרוטאומיקה מרחבית מאפשרת מיפוי של תאי חיסון ואינטראקציות שלהם בתוך רקמות.
- קיימים אתגרים בבניית לוחות נוגדנים והדמיה של רקמות עם פלואורסצנציה אנדוגנית גבוהה.
- טכניקת IBEX מזהה מאפיינים ספציפיים לגידול בחולים עם לימפומה בסיכון גבוה.
- מעט ידוע על הרכב תאי החיסון בפתולוגיות ריאתיות מיקובקטריאליות.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקול שמפחית את הפלואורסצנציה הטבעית של הרקמה תוך שמירה על אותות הנוגדנים.
- לאפשר ניתוח מרחבי של תאי חיסון בדגימות רקמות מורכבות.
- לגשר על פערי ידע באינטראקציות של תאי חיסון ברחבי פתולוגיות שונות.
שיטות ששימשו
- שקופיות עם רקמה טובלות ב-PBS לאחר שחזור אנטיגן.
- חיץ חסימה ותמיסות נוגדנים ראשוניות מוכנות ומיושמות.
- פוטו-הקרנה מתבצעת באמצעות מנורות LED ספציפיות כדי להפחית פלואורסצנציה טבעית.
- הדמיה של שקופיות שלמות מתבצעת כדי לדמיין אינטראקציות של תאי חיסון ותכונות רקמות.
תוצאות עיקריות
- הופחתה משמעותית בפלואורסצנציה טבעית לאחר פוטו-הקרנה.
- גרנולומות וסוגי תאי חיסון הוויזואליזציה ברקמת הריאה.
- נוגדנים ספציפיים זיהו Mycobacterium tuberculosis ליד ליבות נמק.
- הדמיה של IBEX חשפה מאפיינים אנטומיים מפורטים של רקמות ריאה.
מסקנות
- הפרוטוקול משפר את ההדמיה של רקמות מורכבות תוך מזעור פלואורסצנציה טבעית.
- הוא מספק כלי חשוב לחקר אינטראקציות של תאי חיסון במחלות שונות.
- שיטה זו יכולה להתאים למגוון רחב של יישומים קליניים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Multiplexed imaging of highly autofluorescent clinical samples is a persistent bottleneck in translational research, limiting the ability to resolve spatial immune cell phenotypes in archived tissues. The optimized IBEX workflow with iterative bleaching and photoirradiation directly addresses this challenge, enabling high-resolution, quantitative spatial proteomics in FFPE samples using accessible instrumentation. This capability enhances predictive confidence in target validation and supports robust biomarker discovery across diverse disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables deep phenotypic mapping of immune cell populations within intact tissue architecture.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying spatial relationships and cell-cell interactions in disease contexts.
- Facilitates functional target validation through quantitative, multiplexed readouts in clinically relevant samples.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, low-autofluorescence tissue sections for downstream multiplexed imaging workflows.
- Improves assay reproducibility and quantitative signal detection by minimizing background interference.
- Enables scalable, whole-slide imaging for high-content screening of immune and structural markers.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial proteomics outputs with translational biomarker strategies in pulmonary and infectious disease models.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling analysis of archived clinical specimens.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by delivering high-content, spatially resolved data from challenging samples.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling spatial proteomics in FFPE tissues, supporting both early mechanistic studies and translational biomarker validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification through spatially resolved immune profiling.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative multiplexed imaging outputs suitable for comparative analysis.
- Analytics: Provides high-content, whole-slide data for robust statistical comparison of immune cell distributions and tissue features.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by enabling biomarker alignment in archived clinical samples.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adaptable imaging protocol for diverse tissue types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in spatial immune profiling.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enhances reproducibility across sample types.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling robust data generation from archived samples.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in antibody panel design and fluorescence imaging.
- Needs access to widefield microscopy and LED-based photoirradiation infrastructure.
- Demands cross-team standardization for antibody validation and image analysis workflows.
- Adaptable to various FFPE tissue types but may require protocol optimization for different sample matrices.
- Practical limitations include potential epitope loss and spectral overlap, necessitating careful panel design and validation.
