מסך CRISPR רחב גנום לחשיפת גנים רגישים לקרינה ועמידים לרדיו

מחקר זה מתמקד בבדיקת CRISPR ברחבי הגנום וברדיותרפיה. אנו מספקים פרוטוקול לצפייה בגנים רגישים לרדיו ועמידים לקרינה באמצעות מסך CRISPR רחב גנום בתאי סרטן ריאה לאחר הקרנה. אתגרי הניסוי הנוכחיים כוללים את ההשפעות מחוץ למטרה, הנגרמות על ידי המורכבות העצומה של הגנום וקשיים פוטנציאליים בחקר המנגנונים הבסיסיים. בהשוואה לשיטות סקר מסורתיות, CRISPR משיג שינוי גנטי קבוע ומראה דיוק מעולה, מה שהופך אותו לבעל ערך במיוחד במחקר גנומי פונקציונלי וגילוי מטרות. בעתיד, הצוות שלנו יתמקד בלימוד מסך CRISPR in vivo כדי לפתור את הבעיות שמחקר זה השאיר אחריו, ואנו נהיה מחויבים לייעל את טכנולוגיית הקריספר.

[קריין] כדי להתחיל, התאם את צפיפות התאים הדבקה לחמש פעמים 10 בחזקת חמישה תאים למיליליטר. בעזרת פיפטה, מחלקים שני מיליליטר של תרחיף התאים לכל צלחת תרבית של 3.5 סנטימטר לטיפול בקרינה במינונים שונים. מניחים את הכלים באינקובטור המוגדר ל -37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ודוגרים למשך הלילה. מספור כל צלחת תרבות בגודל 3.5 ס"מ מאחת עד חמש, בעזרת טוש. באמצעות מקור קרינה, יש לתת מנות קרינה של 2, 4, 6 ו-8 אפורות, בהתאמה, לצלחות 2 עד 5. התאם את צפיפות התאים המוקרנים לאחת כפול 10 בחזקת חמישה תאים למיליליטר. זרע 10 מיקרוליטר לבאר, המתאים ל -1000 תאים לכל 100 מיקרוליטר לצלחות של שש בארות עם שלושה שכפולים לכל מנת קרינה. לאחר מכן זרעו 30 מיקרוליטר לבאר, המתאימים ל-3000 תאים לכל 100 מיקרוליטר לצלחות של 96 בארות עם חמישה שכפולים לכל מנת קרינה. כעת, מערבבים את המגיב CCK-8 עם מדיום RPMI 1640 ללא FBS ביחס של אחד לתשע. מוסיפים את התערובת לצלחת 96 בארות ומדגרים את הצלחת בחושך למשך שעה. לאחר מכן השתמש בקורא מיקרו-פלטות כדי למדוד את הצפיפות האופטית ב-450 ננומטר. כדי להתחיל בתהליך ההדבקה, הגדר שיפוע ריכוז לוגריתמי עבור נגיף הלנטי מאפס ל-800 יחידות למיליליטר. הוסף את הנפח המתאים של נגיף הלנטי לשני מיקרוליטרים של פוליברן למנה ותן לו להתייצב בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. טפטפו לאט את תערובת הפוליברן של הלנטי-וירוס לכל באר. התאם את צפיפות התאים ההורית לשלוש פעמים 10 בחזקת חמישה תאים למיליליטר וחסן מיליליטר אחד לכל באר של צלחת של 12 בארות. הוסף פורומיצין בשיפוע ריכוז לבארות. לאחר 72 שעות של זיהום, החלף את המדיום בכל באר במדיום שלם המכיל את ריכוז הפורומיצין המינימלי להרג תאים. חשב את ריבוי הזיהום עבור כל באר על סמך התאים ששרדו. התאם את צפיפות התאים הדבקה לאחת כפול 10 בחזקת שבעה תאים למיליליטר. הוסף לנטי-וירוס בריבוי זיהום השווה ל-0.3 ל-30 מיקרוליטר למנה של פוליברן ואפשר לו להתאזן בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. טפטפו לאט את תערובת הלנטי-וירוס והפוליברן לתוך צלחת התרבות של 15 סנטימטר. מערבבים היטב ומדגרים אותו למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. ביום השני לאחר ההדבקה יש לשאוב את המדיום מצלחת התרבות ולהחליף אותו ב-15 מיליליטר של מדיום שלם RPMI 1640 המכיל 10% FBS. חזור על אותו טיפול לתאי ההורים הלא נגועים כביקורת שלילית והמשך בתרבית במשך 72 שעות. כעת, עכל את התאים מכלי תרבית אחד של 15 סנטימטר באמצעות 0.25% טריפסין. השעו מחדש את התאים במדיום השלם RPMI 1640 עם 10% PBS וספרו את מספר התאים. לאחר חילוץ ה-DNA הגנומי ליום האפס, השתמש בספקטרופוטומטר UV של NanoDrop כדי למדוד את ריכוז ה-DNA והטוהר. לתת מינון מתאים של קרינה לתאים בקבוצת הטיפול ולהשאיר את תאי קבוצת הביקורת ללא טיפול כדי להתפשט כרגיל. לאחר 14 יום של טיפול, יש לעכל הן את תאי קבוצת הטיפול והן את תאי קבוצת הביקורת באמצעות 0.25% טריפסין. השעו מחדש את התאים במדיום שלם RPMI 1640 עם 10% FBS. צנטריפוגה של התאים ב -300 גרם למשך חמש דקות והשליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של PBS. לאחר חזרה על שלב הצנטריפוגה, חלץ DNA גנומי של יום 14 מהגלולה וקבע את ריכוז ה-DNA. לאחר מכן, הכינו את הפריימרים הנדרשים ודללו אותם ל -10 מיקרומולר. לאחר הוספת הרכיבים להקמת מערכת תגובה של 20 מיקרוליטר, צנטריפוגה את הצינור לזמן קצר ב-300 G למשך חמש שניות. לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז, הכינו את הג'ל, הסירו ממנו את המסרק ומלאו את מיכל האלקטרופורזה בחיץ מספיק כדי לכסות את הג'ל. הוסף מאגר טעינה לדגימת ה-DNA וערבב היטב. לבסוף, העמיסו את התערובת לבארות והתחילו את היווצרות מושבת האלקטרופורזה לאחר 14 יום גילתה כי חשיפה לשני גריי של קרינה הפחיתה משמעותית את מספר המושבות ששרדו בהשוואה לאפס גריי. בדיקת CCKA הראתה ירידה משמעותית בכדאיות התאים בשני גריי עם ירידה נוספת במינוני קרינה גבוהים יותר. טיפול בריכוזים הולכים וגדלים של פורומיצין במשך 72 שעות הראה כי מיקרוטולר אחד היה הריכוז המינימלי הנדרש לחיסול תאי A549. אימות PCR הראה רצועות נפרדות ב-231 זוגות בסיסים, מה שאישר את האורך הצפוי של רצפי sgRNA בספריית ה-CRISPR. ניתוח ריצוף גילה שכ-60% מהקריאות מופו בהצלחה לגנום הייחוס. ספירת הקריאה של sgRNA עקבה אחר התפלגות פואסון, ותואמת את הציפיות התיאורטיות למסך בקנה מידה גנומי. ניתוח PCA ומפת חום הראה שונות בין-קבוצתית גבוהה ושונות בין-קבוצתית נמוכה, מה שמאמת את העקביות הניסויית. ניתוח אונטולוגיה של גנים זיהה את תגובת הנזק ל-DNA כמסלול מועשר מוביל מבין 15 התוצאות המובילות.