Name: בדיקת חילופי שומנים בתאים חיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: חקור חילופי שומנים בתאים חיים באמצעות ציקלודקסטרין לחקר אינטראקציות בין קולטנים לקרום התא. שיטה זו מאפשרת הבנה מדויקת של דינמיקת קרומים ומיקום קולטנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+lipid+rafts+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Functions of lipid rafts in biological membranes.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 111-136 (1998).</li>
<li>Brown, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+rafts%2C+detergent-resistant+membranes%2C+and+raft+targeting+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Lipid rafts, detergent-resistant membranes, and raft targeting signals.</a> Physiology. 21, 430-439 (2006).</li>
<li>Schroeder, R., London, E., Brown, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+saturated+acyl+chains+confer+detergent+resistance+on+lipids+and+glycosylphosphatidylinositol+%28GPI%29-anchored+proteins%3A+GPI-anchored+proteins+in+liposomes+and+cells+show+similar+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interactions between saturated acyl chains confer detergent resistance on lipids and glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins: GPI-anchored proteins in liposomes and cells show similar behavior.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (25), 12130-12134 (1994).</li>
<li>Suresh, P., Miller, W. T., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+exchange+shows+insulin+receptor+activity+is+supported+by+both+the+propensity+to+form+wide+bilayers+and+ordered+raft+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phospholipid exchange shows insulin receptor activity is supported by both the propensity to form wide bilayers and ordered raft domains.</a> J Biol Chem. 297 (3), 101010(2021).</li>
<li>Delle Bovi, R. J., Kim, J., Suresh, P., London, E., Miller, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterol+structure+dependence+of+insulin+receptor+and+insulin-like+growth+factor+1+receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Sterol structure dependence of insulin receptor and insulin-like growth factor 1 receptor activation.</a> Biochim Biophys Acta Biomembr. 1861 (4), 819-826 (2019).</li>
<li>Zidovetzki, R., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cyclodextrins+to+manipulate+plasma+membrane+cholesterol+content%3A+evidence%2C+misconceptions+and+control+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Use of cyclodextrins to manipulate plasma membrane cholesterol content: evidence, misconceptions and control strategies.</a> Biochim Biophys Acta. 1768 (6), 1311-1324 (2007).</li>
<li>Ohtani, Y., Irie, T., Uekama, K., Fukunaga, K., Pitha, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+%CE%B1-%2C+%CE%B2-+and+%CE%B3-cyclodextrins+on+human+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Differential effects of α-, β- and γ-cyclodextrins on human erythrocytes.</a> Eur J Biochem. 186 (1-2), 17-22 (1989).</li>
<li>Suresh, P., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+cyclodextrin-induced+lipid+substitution+to+study+membrane+lipid+and+ordered+membrane+domain+%28raft%29+function+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Using cyclodextrin-induced lipid substitution to study membrane lipid and ordered membrane domain (raft) function in cells.</a> Biochim Biophys Acta Biomembr. 1864 (1), 183774(2022).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+replacement+of+plasma+membrane+outer+leaflet+phospholipids+and+sphingolipids+in+cells+with+exogenous+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Efficient replacement of plasma membrane outer leaflet phospholipids and sphingolipids in cells with exogenous lipids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14025-14030 (2016).</li>
<li>Yoshimasa, Y., Paul, J. I., Whittaker, J., Steiner, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+amino+acid+replacements+within+the+tetrabasic+cleavage+site+on+the+processing+of+the+human+insulin+receptor+precursor+expressed+in+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of amino acid replacements within the tetrabasic cleavage site on the processing of the human insulin receptor precursor expressed in Chinese hamster ovary cells.</a> J Biol Chem. 265 (28), 17230-17237 (1990).</li>
<li>Gaus, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+lipid+structure+and+raft+domains+in+living+cells+with+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Visualizing lipid structure and raft domains in living cells with two-photon microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (26), 15554-15559 (2003).</li>
<li>Klymchenko, S., Kreder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+probes+for+lipid+rafts%3A+From+model+membranes+to+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent probes for lipid rafts: From model membranes to living cells.</a> Chem Biol. 21 (1), 97-113 (2014).</li>
<li>Pike, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+receptors%2C+lipid+rafts+and+caveolae%3A+An+evolving+story%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+ActaMol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Growth factor receptors, lipid rafts and caveolae: An evolving story.</a> Biochim Biophys ActaMol Cell Res. 1746 (3), 260-273 (2005).</li>
<li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+detergent-resistant+membrane+domains%3A+does+phase+separation+occur+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Structure of detergent-resistant membrane domains: does phase separation occur in biological membranes.</a> Biochem Biophys Res Commun. 240 (1), 1-7 (1997).</li>
<li>Lin, Q., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+artificial+plasma+membrane+mimicking+vesicles+with+lipid+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Preparation of artificial plasma membrane mimicking vesicles with lipid asymmetry.</a> PLoS One. 9 (1), e87903(2014).</li>
<li>Sezgin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+membrane+structure+and+protein+behavior+using+giant+plasma+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles.</a> Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).</li>
<li>Deveaux, P. F., Hermann, A., Ohlwein, N., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+lipid+flippases+can+modulate+membrane+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+Biomembr%22%5BJournal%5D)">How lipid flippases can modulate membrane structure.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembr. 1778 (7), 1591-1600 (2008).</li>
<li>Balasubramaniam, K., Mirnikjoo, B., Schroit, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+externalization+of+phosphatidylserine+at+the+cell+surface%3A+implications+for+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulated externalization of phosphatidylserine at the cell surface: implications for apoptosis.</a> J Biol Chem. 282 (25), 18357-18364 (2007).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replacing+plasma+membrane+outer+leaflet+lipids+with+exogenous+lipid+without+damaging+membrane+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Replacing plasma membrane outer leaflet lipids with exogenous lipid without damaging membrane integrity.</a> PLoS One. 14 (10), e0223572(2019).</li>
<li>Contreras, F. X., Sanchez-Magraner, L., Alonso, A., Goni, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transbilayer+%28flip-flop%29+lipid+motion+and+lipid+scrambling+in+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Transbilayer (flip-flop) lipid motion and lipid scrambling in membranes.</a> FEBS Letters. 584 (9), 1779-1786 (2010).</li>
<li>Suresh, P., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%CE%B1CD-based+plasma+membrane+outer+leaflet+lipid+exchange+in+mammalian+cells+to+study+insulin+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Approach+Study+Memb+Struct+A+Exp%22%5BJournal%5D)">MαCD-based plasma membrane outer leaflet lipid exchange in mammalian cells to study insulin receptor activity.</a> Biophys Approach Study Memb Struct A Exp. 700, 485-507 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DLPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td></td> 850335-1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine <td></td></tr><tr><td>(DMPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td></td> 850345-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine <td></td></tr><tr><td>(DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td></td> 850375-1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine <td></td></tr><tr><td>(DPPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td></td><td></td>850355</tr><tr><td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td></td> 850365-1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine <td></td></tr><tr><td>(POPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-אינסולין ובטא; נוגדנים</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td></td> CST3025-Anti-pYpY1162<td></td></tr><tr><td>/1163 נוגדן לקולטן אינסולין</td><td>R& די סיסטמס בע"מ</td><td>AF2507</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG, טכנולוגיית איתות תאי נוגדנים מקושרים ל-HRP</td><td></td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות זכוכית בורוסיליקט (12 x 75 מ"מ)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-961-26</td><td></td></tr><tr><td>ספינגומיאלין מוח (bSM)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860062</td><td></td></tr><tr><td>ספינגומיאלין ביצה (eSM)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860061</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי ( FBS)</td><td>Corning</td><td>35-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>G418 מלח דיסולפט</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>Gibco תמיסה אנטיביוטית-אנטי-פטרייתית (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Dulbecco' מדיום נשר שונה (DMEM, 4.5 גרם/ליטר גלוקוז, L-גלוטמין, סודיום פירובט)</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>חזיר ג'יבקו' s F12 media</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Gibco L-glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030032</td><td></td></tr><tr><td>Gibco MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Gibco phosphate buffered salt (PBS) ללא סידן ומגנזיום (0.144 גרם/ליטר KH2PO4, 9 גרם/ליטר NaCl, 0.795 גרם/ליטר Na2- HPO4 (נטול מים))Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>10010023</tr><tr><td>Gibco Trypsin-EDTA (0.05%), פנול אדום</td><td>תרמו פישר Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>כרומטוגרפיה שכבה דקה בעלת ביצועים גבוהים (HP-TLC)</td><td>Merck</td><td>HP-TLC סיליקה ג'ל 60 צלחות</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P PVDF ממברנה</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Methotrexate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>454126</td><td></td></tr><tr><td>Methyl-&alpha;- ציקלודקסטרין (M&alpha; CD)</td><td>AraChem</td><td>CDexA076/BR</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Western Blotting Substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אורתוונדאט, מופעל</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>5.08605</td><td></td></tr></tbody></table>

בדיקת חילופי שומנים בתאים חיים

Lipid Exchange Assay in Living Cells

כדי להדגים את השינוי הנצפה בהרכב השומנים התאיים לאחר ההחלפה, ביצענו HP-TLC על תאי CHO IR לאחר חילופי SM במוח (bSM) ו-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) (איור 1). במקרים בהם משתמשים בספינגומיאלינים כמו bSM להחלפה, ניכרת עלייה בעוצמת פס ה-SM, יחד עם ירידה בעוצמת פס ה-PC ביחס לבקרה הלא מטופלת. לעומת זאת, בעת החלפת פוספטידילכולינים כמו DOPC, רצועת ה-PC נעשית אינטנסיבית יותר בעוד שרצועת ה-SM נעשית פחות אינטנסיבית. ניתן לקבוע את יעילות ההחלפה על ידי מדידת העוצמות של מחלקת השומנים המוח...

Lipid rafts are dynamic, ordered domains in the plasma membrane often formed during membrane protein clustering and signaling. The lipid identity of the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

כדי לבדוק את האינטראקציה של חלבון עם שומנים היעד השתמשנו macs ו Annexin V-מצומדות חרוזים מגנטיים שלפוחית ​​השומנים מסונתז מ השומנים היעד Annexin V-מחייב phosphatidylserine. חלבונים חייב השומנים היעד הם שיתוף מטוהרים ונותחו לאחר elution מן החרוזים.

שלפוחיות בתיווך זיקה ליפידים כרומטוגרפיה באמצעות Cell מגנטי מיון פעיל (LIMACS): שיטה חדשה לנתח חלבון, שומנים אינטראקציה

פרוטאוליפוזומים משמשים לחקר תעלות מטוהרות וטרנספורטרים שהוקמו מחדש בסביבה ביוכימית מוגדרת היטב. מודגם הליך ניסיוני למדידת פליטה בתיווך חלבונים אלה. מתוארים השלבים להכנת פרוטאוליפוסומים, ביצוע ההקלטות וניתוח נתונים כדי לקבוע כמותית את התכונות הפונקציונליות של החלבון המשוחזר.

Proteoliposome מבוסס הזרימה Assay כדי לקבוע מאפייני מולקולה בודדת של Cl<sup-&gt;</sup&gt; ערוצים ומסועים

אנו מציגים פרוטוקול functionalize זכוכית עם טלאי חלבון ננומטריים המוקפים bilayer שומנים נוזל. מצעים אלו עולים בקנה אחד עם מיקרוסקופיה אופטית מתקדמת וצפויים להוות פלטפורמה ללימודי הדבקה ו נדידת תאים.

מערכי ננו-אשכול ליגנד בתוך bilayer שומנים נתמך

נתאר כאן fluorometric assay ללא תא הביוכימי לקביעת ה-HDL-השומנים peroxidation. זה מהיר ולא לשחזור assay יכול לשמש כדי לקבוע פונקציה HDL במחקרים בקנה מידה גדול והוא יכול לתרום להבנת פונקציית ה-HDL מחלות אנושיות.

ללא תא הביוכימי Fluorometric Assay אנזימטי למדידה תפוקה גבוהה של שומנים בדם Peroxidation של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה

פרוטוקול זה מספק גישה יעילה מדידת ספיגת כולסטרול LDL במחירים זרם בזמן אמת באמצעות תא חי הדמיה למערכת סוגי תאים שונים. טכניקה זו מספקת פלטפורמה למסך את פעילות פרמקולוגית של תרכובות להשפיע על זרם LDL תוך מעקב אחר עבור תא ומורפולוגיה cytotoxicity ומכאן פוטנציאליים.

ספיגת כולסטרול LDL Assay באמצעות תא חי הדמיה ניתוח עם התא לניטור תקינות

מוצג כאן מבחן פלואורסצנטי רגיש לניטור פעילות אפוליפופרוטאין N-אצילטרנספראז באמצעות פפטיד דיאצילגליצריל ואלקין-פוספוליפידים כמצעים עם כימיה של קליקים.

בדיקה פלואורומטרית מבוססת קליק-כימיה עבור אפוליפופרוטאין N-אצילטרנספראז מאיפיון אנזים ועד סינון תפוקה גבוהה

אנו מציגים שיטה לרכישת קורסי זמן לכתב פלואורסצנטי מתאים בודדים באמצעות מערכים micropatterned. הפרוטוקול מתאר הכנת מערכים חד-תאיים, התקנה ותפעול של מיקרוסקופיית זמן-לשגות של סריקת תאים חיים וכלי לניתוח תמונות בקוד פתוח לצורך בחירה מראש אוטומטית, בקרה חזותית ומעקב אחר קורסי זמן פלואורסצנטיים משולבים בתאים לכל אתר הידבקות.

הדמיית תא חי של מערכים חד-תאיים (LISCA) - טכניקה רב-תכליתית לכימות קינטיקה תאית

כאן, אנו מתארים פרוטוקולים באמצעות חיישני שומנים פלואורסצנטיים וליפוזומים כדי לקבוע אם חלבון מחלץ ומעביר פוספטידילסרין או פוספטידילינוזיטול 4-פוספט במבחנה.

מדידות מבוססות פלואורסצנטיות של פוספטידילסרין/פוספטידילינוזיטול 4-חילופי פוספט בין ממברנות

פרוטוקול זה מתאר היווצרות של תאים מחקים שלפוחיות חד-שומנים ורב-שומנים, דו-שכבתי שומנים נתמכים, ושכבות שומנים מושעות. מודלים במבחנה אלה ניתן להתאים לשלב מגוון רחב של סוגי שומנים וניתן להשתמש בהם כדי לחקור מולקולות שונות ואינטראקציות macromolecule.

הרכבה של חיקוי תאים מודלים נתמכים ומושעים של בולי עץ לחקר אינטראקציות מולקולריות

ליפופגיה היא צורה סלקטיבית של אוטופגיה הכוללת פירוק של טיפות שומנים. תפקוד לקוי בתהליך זה קשור להתפתחות סרטן. עם זאת, המנגנונים המדויקים עדיין לא מובנים במלואם. פרוטוקול זה מתאר גישות הדמיה כמותית כדי להבין טוב יותר את יחסי הגומלין בין אוטופגיה, מטבוליזם של שומנים והתקדמות סרטן.

חקר הוויסות של קטבוליזם טיפות שומנים באמצעות ליפופגיה

כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים למדידת כמות הפוספוליפיד הפלואורסצנטי שהוסר במיוחד מחלקיקי תורם שומנים על ידי ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) הקיים בפלזמה או בסרום אנושי שלם. הראינו שמדד זה של פונקציונליות HDL מנבא מחלות לב וכלי דם אירועיות.

בדיקת פליטת פוספוליפידים ספציפית לליפופרוטאין בצפיפות גבוהה

חקור חילופי שומנים בתאים חיים באמצעות ציקלודקסטרין לחקר אינטראקציות בין קולטנים לקרום התא. שיטה זו מאפשרת הבנה מדויקת של דינמיקת קרומים ומיקום קולטנים.

בדיקת חילופי שומנים בתאים חיים

גלה סרטונים נוספים