Name: תוצרי קצה מתקדמים של גליקציה מרגישים תאי עצב דמויי חישה אנושיים לזרם סידן המושרה על ידי קפסאיצין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: חקור כיצד גליקציה של קולגן מגבירה רגישות תאי עצב דמויי חישה לקפסאיצין באמצעות מדידת זרם סידן. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לבחון מנגנוני כאב ומטרות מולקולריות במחלות ניווניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תרבית 1. SH-SY5Y והתמיינות לתאי עצב דמויי חישה
הערה 1: כל השלבים הקיימים בסעיף זה צריכים להיעשות מתחת למכסה זרימה למינר, וכל הפתרונות והאספקה צריכים להיות סטריליים.
<ol><li>ראשית, הכינו בקבוק תרבות (25 ס"מ2) על ידי הוספת 5 מ"ל מדיום תרבות. הערה: להפשרה, הרחבה ותחזוקה של סוג תאים זה, השתמש בתערובת של מדיום תרבית: Dulbecco Modified Eagle's and Ham's Medium F12 (DMEM/F12) בתוספת 10% סרום בקר עוברי מומת בחום ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.</li>
	<li>לאחר מכן, הסר את צינור ה-cryotube המכיל את תאי SH-SY5Y מהחנקן הנוזלי ושמור אותו על קרח. הפשירו את התאים באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של מדיום תרבית שלם לקריוביאל, העביר את התאים לצינור של 15 מ"ל, הוסף 3 מ"ל של מדיום תרבית שלם (DMEM/F12 בתוספת 10% סרום בקר עוברי מומת בחום), וערבב על ידי משיכתו שוב ושוב והוצאתו בחזרה לתוך הצינור באמצעות פיפטה.</li>
	<li>פיפטו את התאים לתוך צינור 15 מ"ל וצנטריפוגה ב -290 גרם. השליכו את הסופרנטנט כדי להסיר דימתיל סולפוקסיד (DMSO), חומר מגן קריו המשמש למניעת היווצרות גבישי קרח במהלך תאי ההקפאה.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של מדיום תרבית לכדור התא, ערבב אותם היטב בעזרת פיפטה, והניח אותם בבקבוק תרביתבגודל 25 ס"מ 2 כדי להרחיב את התאים. הנח את התאים בחממה באווירה לחה של 5% CO2 ב -37 מעלות צלזיוס. הערה: ניתן להשתמש בתאים כאשר הם מגיעים לכ-80% מפגש. לצורך התמיינות עצבית, מומלץ להשתמש בתאי SH-SY5Y עד למעבר התא עשרים.</li>
	<li>הכינו את מטריצת הקולגן החוץ-תאית (100 מיקרוגרם/מ"ל) על ידי דילול קולגן מסוג I של זנב חולדה ב-PBS סטרילי, ושפכו 1 מ"ל מהתמיסה הזו לצלחת פטרי (35/10 מ"מ) לציפוי.</li>
	<li>דגרו זאת בחממה באווירה לחה של 5% CO2 למשך כשעה אחת.</li>
	<li>לאחר תקופה זו, שטפו את הצלחת פעמיים עם PBS סטרילי, ואז ספרו תאים באמצעות תא נויבאואר.</li>
	<li>כדי לספור תאים, יש לשטוף תחילה אתבקבוק התרבות בגודל 25 ס"מ המכיל את התא עם 5 מ"ל PBS סטרילי כדי להסיר את כל מדיום התרבות. לאחר מכן הסר את ה-PBS הסטרילי, הוסף 3 מ"ל של 0.05% טריפסין לתאים, והנח אותם באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך כ-3-5 דקות להשלמת ניתוק התאים.</li>
	<li>לאחר מכן, הסר את התאים מהחממה, הוסף 6 מ"ל מדיום תרבית לבקבוק התרבית והעביר תמיסה זו לצינור של 15 מ"ל. צנטריפוגה ב -290 גרם למשך 5 דקות.</li>
	<li>הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את התאים היטב ב -1 מ"ל של מדיום תרבית שלם.</li>
	<li>לבסוף, ספרו את התאים באמצעות תא ספירה של נויבאואר. מערבבים 20 מיקרוליטר תאים ו -20 מיקרוליטר טריפן כחול, ומוסיפים 10 מיקרוליטר מהתערובת הזו לתא נויבאואר. ספור את התאים החיים שאינם מוכתמים בכחול.</li>
	<li>לוח 5 × 104 תאים/מ"ל תאים בצלחת פטרי (35/10 מ"מ) על אותו מדיום תרבית שתואר קודם. השתמש בנפח הכולל של 1 מ"ל לצלחת.</li>
	<li>לאחר מכן, המתינו 24 שעות כדי להתחיל את פרוטוקול ההתמיינות העצבית. לשם כך, הסר את מדיום התרבית והחלף אותו ב-1 מ"ל של DMEM/F12 בתוספת 2% סרום בקר עוברי מומת בחום, 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-10 מיקרומטר חומצה רטינואית טראנס (RA 10 מיקרומטר).</li>
	<li>המתן 48 שעות והחלף את מדיום התרבות כל יום למשך 3 ימים. הנח את התאים בחממה באווירה לחה של 5% CO2 ב -37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>ביום החמישי, הוציאו את המדיום מהתאים והוסיפו 1 מ"ל של תרבית ללא סרום בתוספת גורם נוירוטרופי שמקורו במוח אנושי (BDNF 50 ננוגרם/מ"ל) בכל צלחת. הערה: נבדק BDNF מחברות שונות (ראה טבלת חומרים). כולם עבדו באותו אופן.</li>
	<li>ביום השביעי להתמיינות, שטפו את התאים עם PBS סטרילי פעם אחת והשתמשו בתאי עצב דמויי חוש לניסויים. אם אי אפשר להשתמש בתאים אלה באופן מיידי לניסויים, הוסף מדיום תרבית ללא סרום כדי לשמור אותם בחיים עד השימוש. הערה: בתום ההתמיינות העצבית, יש צורך לשטוף תאים עם PBS סטרילי כדי להסיר את ה-BDNF שנותר, תוך הימנעות מרעילות תאים.</li>
</ol>2. קולגן מסוכרר ותהליך גליקציה
הערה: כל השלבים בסעיף זה חייבים להיעשות מתחת למכסה זרימה למינר, וכל הפתרונות והאספקה חייבים להיות סטריליים.
<ol><li>הכן את גליקציה של קולגן על ידי דגירה של קולגן מסוג I ממצב סיבי זנב חולדה (3.89 מ"ג/מ"ל) עם 200 מ"מ D-ריבוז, 160 מ"מ D-גלוקוז ו-200 מ"מ D-תראוז ב-4 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים. הערה: להכנת קולגן מסוכרר, שקלו את הסוכרים לפי המשקל המולקולרי שלהם וערבבו אותם עם קולגן מסוג I ממצב סיבי זנב חולדה (3.89 מ"ג/מ"ל).</li>
	<li>דגרו על תרבית תאי עצב דמויי תחושה למשך 24 שעות עם מטריצה חוץ-תאית של קולגן מסוכרר (ECM-GC, 100 מק"ג/מ"ל) או מטריצה חוץ-תאית רגילה של קולגן (ECM-NC, 100 מק"ג/מ"ל) שהוכנה במדיום תרבית DMEM/F12 ללא סרום ותוספי אנטיביוטיקה.</li>
</ol>3. בדיקת זרם סידן
<ol><li>לזרם סידן, השתמש בערכת בדיקת שטף הסידן והכן את התמיסות על פי הוראות היצרן, כמפורט להלן.</li>
	<li>בתחילה, הכינו 1 מ"ל של טעינת צבע Fluo-8 על ידי הוספת 2 מיקרוליטר של תמיסת מלאי Fluo-8 ב-998 מיקרוליטר של מאגר בדיקה 1x (תערובת של מאגר HBSS ו-10x Pluronic F127 Plus. הערה: פתרון עבודה זה יציב לפחות שעתיים בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>מאוחר יותר, דגרו 250 מיקרוליטר של תמיסה זו בכל צלחת מצופה של תאי עצב דמויי חוש שהתמיינו בעבר וטופלו ב-ECM-NC או ECM-GC למשך 30 דקות באווירה לחה של 5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוציאו את המנה מהחממה ושמרו אותה ב-RT (בחושך) למשך 30 דקות. הערה: תמיסה זו הופכת לציטוטוקסית אם הדגירה של שעתיים היא אקסטרפולציה. הכן את תמיסת הקפסאיצין בתקופת הדגירה.</li>
</ol>4. אינדוקציה של קפסאיצין
הערה: קפסאיצין, אגוניסט TRPV1, שימש להשראת זרימת סידן בתאים.
<ol><li>שקלו ודללו קפסאיצין ב-1% אתנול ומים טהורים במיוחד. לאחר מכן, הכינו תמיסה בריכוז של 2 מיקרומטר, שגם היא דוללה במים טהורים במיוחד. הערה: יש להכין תמיסת קפסאיצין ביום השימוש. לדלל קפסאיצין תחילה באתנול ולאחר מכן במים; אחרת, זה יזרז.</li>
	<li>הוסף 250 מיקרוליטר של תמיסת קפסאיצין של 2 מיקרומטר לכל צלחת פטרי בגודל 35/10 מ"מ כך שהריכוז הסופי יהיה 1 מיקרומטר. הערה: ריכוז תמיסת המלאי של קפסאיצין היה 2 מיקרומטר כדי להבטיח פיזור טוב יותר ולהימנע משיאי פלואורסצנטיות מבודדים.</li>
</ol>5. הדמיית זרם סידן וניתוח מיקרוסקופיה קונפוקלית
הערה: ההדמיה בוצעה במיקרוסקופ קונפוקלי המצויד באובייקט 20x/0.75NA ובלייזר עירור 488 ננומטר (עוצמה של 0.5%). הפליטה זוהתה ב-520 ננומטר. התאים נסרקו בצירי xy (512 x 512 פיקסלים) לאורך זמן (t) במהירות של 600 הרץ עם מרווח רכישה של 433 אלפיות השנייה וזמן רכישה כולל של 5 דקות. ההדמיה בוצעה ב-37 מעלות צלזיוס כדי לשמור על מצבם הפיזיולוגי של התאים באמצעות תוכנת המיקרוסקופיה.
<ol><li>הכינו מזרק עם 250 מיקרוליטר של תמיסת קפסאיצין של 2 מיקרומטר (הריכוז הסופי בצלחת יהיה 1 מיקרומטר) וחברו אותו לסט ורידים בקרקפת - פרפר מסוג 23 GA סטרילי. אבטח את המזרק באמצעות מעמד מעבדה ומהדק.</li>
	<li>הניחו את צלחת הפטרי על במת המיקרוסקופ ובזהירות יתרה הניחו את מחט הקרקפת בצלחת הפטרי, הימנעו ממגע עם התחתית, אין לטבול את קצה המחט בנוזל. הערה: ניתן להשתמש בנייר דבק כדי לתקן את מיקום הקרקפת.</li>
	<li>מצא שדה עם מספר מתאים של תאים (יותר מ-20) והתאם את המיקוד באמצעות אור שדה בהיר.</li>
	<li>התחל מצב Live עם לייזר 488 ננומטר והתאם את פרמטרי המיקוד והתאורה.</li>
	<li>התחל את הקלטת הרכישה, ולאחר תקופת הבסיס (t = 0 עד t = 60 שניות), יש למרוח 250 מיקרוליטר של 2 מיקרומטר קפסאיצין ולדחוף בעדינות את בוכנת המזרק כדי לעורר את זרימת הסידן לתאים. הערה: זמן רכישת ההקלטה הסופי היה כ-300 שניות לצלחת.</li>
</ol>6. עיבוד לאחר / ניתוח נתונים
<ol><li>בצע את ניתוח התאים באמצעות תוכנת המיקרוסקופיה במצב כמות . ראשית, נתח תאי ספייק פלואורסצנטיים לפני ואחרי גירוי הקפסאיצין.</li>
	<li>צור אזור עניין (ROI) בכל תא מגיב, כלומר תאים המציגים עלייה פלואורסצנטית לאחר קפסאיצין. הקפידו לצייר החזר ROI בכל אזור התא, כפי שמודגם לעיל (איור 1).</li>
	<li>ייצא את הנתונים בקובץ ערכים מופרדים באמצעות פסיקים (CSV) לצורך ניתוח עוקב.</li>
	<li>לחלופין, בצע את הניתוח באמצעות התוכנה הזמינה בחינם FIJI7 (https://fiji.sc).<ol><li>כדי לפתוח את קובצי התמונה, השתמש בתוסף Bio-Formats על ידי ניווט אל File &gt; Import &gt; Bio-Formats ובחירת הקובץ.</li>
	</ol></li>
	<li>לאחר מכן, השתמשו בכלי זכוכית מגדלת כדי להגדיל את התצוגה ובכלי בחירה ביד חופשית כדי לצייר אזור עניין (ROI) סביב התאים המגיבים.</li>
	<li>לאחר ציור כל החזר ROI, לחץ על מקש T כדי להוסיף אותו למנהל ה-ROI. חזרו על התהליך הזה עבור כל התאים המעניינים (איור 2).</li>
	<li>לאחר הוספת כל ההחזר על ההשקעה, עבור לחלון מנהל החזר ההשקעה , בחר את כל ההחזר על ההשקעה ולאחר מכן נווט אל ניתוח &gt; הגדרת מדידות בתפריט הראשי.</li>
	<li>לאחר מכן, חזרו למנהל ההחזר על ההשקעה ובחרו עוד &gt; Multi Measure כדי למדוד את העוצמה בכל המסגרות. התוצאות יופיעו בחלון חדש; ייצא כקובץ CSV על-ידי מעבר אל קובץ &gt; שמירה בשם. הערה: ניתן לנתח את קובץ ה-CSV בתוכנות Excel, Google Sheets ו-GraphPad. השתמש במשוואה ΔF/F0 = (F(t) - F0)/F0 כדי להמיר ערכי עוצמת הקרינה המתקבלים עם ערכת בדיקת שטף הסידן Fluo-8 למדד יחסי של שינוי שטף הסידן. כאן, F0 מייצג את הקרינה הבסיסית, המחושבת כעוצמה הממוצעת מתמונות שצולמו מ-t = 0 s עד t = 60 שניות לפני גירוי עם קפסאיצין. F(t) הוא הערך של עוצמת הקרינה המקסימלית שנצפתה לאחר הגירוי, המאפשרת להעריך את שיא זרם הסידן. גישה זו מדגישה את העלייה בקרינה ביחס לקו הבסיס, כאשר עלייה ב-ΔF/F0 מצביעה על רמת סידן תוך תאית מוגברת.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68036/68036fig01v2.jpg"> איור 1: דוגמה להחזר ROI בתאים שנבחרו עבור ניתוח זרם סידן בתוכנת LAS X. (A) ממשק LAS X במצב כמות. המלבן הוורוד מציג את לשונית הכימות. המלבן הצהוב מציג את הכלי ציור פולי-קווים, ומלבן הציאן מציג את כלי התצוגה וההתקרבות. (B) שדה ראייה (FOV) שנלכד. (C) התקרב ל-FOV כדי להקל על ציור החזר ה-ROI בתא כולו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68036/68036fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68036/68036fig2v5.jpg"> איור 2: דוגמה להחזר ROI בתאים שנבחרו עבור ניתוח זרם סידן בתוכנת FIJI. (A) ממשק FIJI המציג את התפריט הראשי והכלי. הריבוע האדום מציג את הכלי זכוכית מגדלת, והריבוע הירוק מציג את הבחירה ביד חופשית. (B) שדה ראייה (FOV) שצולם עם זום אין והחזר ROI מצויר. (ג) חלון מנהל ההחזר על ההשקעה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68036/68036fig2v5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
7. פתרון בעיות
<ol><li>אם התמונה אינה ממוקדת, נסה את הפעולות הבאות:<ol><li>בדוק את הידבקות הקלטת; אם הוא השתחרר, הדבר עלול לגרום למחט לזוז ולהשפיע על המיקוד.</li>
		<li>חבר מחדש את המחט עם סרט נוסף ליציבות מוגברת.</li>
		<li>החלפת מחטים סטנדרטיות. השתמש בקצות מחט שיניים כפופות מראש כדי לשפר את היישור על הצלחת.</li>
	</ol></li>
	<li>אם התאים מציגים אות רווי, נסה את הצעדים הבאים:<ol><li>הפחת את עוצמת הלייזר ואת הגדרות ההגברה.</li>
		<li>ודא את זמן הדגירה של המגיב . אם זה חורג מהמלצת היצרן, זה עלול להוביל לרוויית אותות, ולסבך את זיהוי זרם הסידן.</li>
	</ol></li>
	<li>עקוב אחר ההצעות הנוספות הבאות לפתרון בעיות:<ol><li>כיול רגיל: ודא שציוד ההדמיה מכויל באופן קבוע כדי לשמור על איכות המיקוד וזיהוי האותות.</li>
		<li>שינויים במסמך: נהל יומן של כל ההתאמות שבוצעו בפרוטוקול לעיון עתידי וכדי להקל על פתרון בעיות.</li>
		<li>התאמות תגובתיות: אם הבעיות נמשכות, שקול לבדוק עם ריכוזי ריאגנטים שונים או שיטות חלופיות לזיהוי אותות.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Bierhaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+RAGE%2C+the+receptor+for+advanced+glycation+end+products%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Understanding RAGE, the receptor for advanced glycation end products.</a> J Mol Med. 83 (11), 876-886 (2005).</li>
<li>Hudson, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+receptor+for+advanced+glycation+endproducts%3A+A+new+target+for+therapeutic+intervention+in+diabetic+complications+and+inflammatory+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Blockade of receptor for advanced glycation endproducts: A new target for therapeutic intervention in diabetic complications and inflammatory disorders.</a> Arch Biochem Biophys. 419 (1), 80-88 (2003).</li>
<li>Dandia, H., Makkad, K., Tayalia, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycated+collagen+-+a+3D+matrix+system+to+study+pathological+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Glycated collagen - a 3D matrix system to study pathological cell behavior.</a> Biomater Sci. 7 (8), 3480-3488 (2019).</li>
<li>Bufalo, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+sensory+neuron-like+cells+and+glycated+collagen+matrix+as+a+model+for+the+screening+of+analgesic+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Human sensory neuron-like cells and glycated collagen matrix as a model for the screening of analgesic compounds.</a> Cells. 11 (2), 247(2022).</li>
<li>Frias, B., Merighi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsaicin%2C+nociception+and+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Capsaicin, nociception and pain.</a> Molecules. 21 (6), 797(2016).</li>
<li>Lam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAGE-dependent+potentiation+of+TRPV1+currents+in+sensory+neurons+exposed+to+high+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">RAGE-dependent potentiation of TRPV1 currents in sensory neurons exposed to high glucose.</a> PLoS One. 13 (2), e0193312(2018).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+activity+and+substance+P+release+are+required+for+corneal+cold+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">TRPV1 activity and substance P release are required for corneal cold nociception.</a> Nat Commun. 10 (1), 5678(2019).</li>
<li>Mickle, A. D., Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+TRP+channels%3Athe+key+transducers+of+nociception+and+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Mol+Biol+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Sensory TRP channels:the key transducers of nociception and pain.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 131, 73-118 (2015).</li>
<li>Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+for+analgesic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Pain%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging for analgesic drug discovery.</a> Neurobiol Pain. 11, 100083(2022).</li>
<li>Vetter, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+Nav+types+endogenously+expressed+in+human+SH-SY5Y+neuroblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Characterisation of Nav types endogenously expressed in human SH-SY5Y neuroblastoma cells.</a> Biochem Pharmacol. 83 (11), 1562-1571 (2012).</li>
<li>Dekker, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+human+Nav1.8+expressed+in+SH-SY5Y+neuroblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Analysis of human Nav1.8 expressed in SH-SY5Y neuroblastoma cells.</a> Eur J Pharmacol. 528 (1-3), 52-58 (2005).</li>
<li>Lam, P. M. W., Hainsworth, A. H., Smith, G. D., Owen, D. E., Davies, J., Lambert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+recombinant+human+TRPV1+receptors+expressed+in+SH-SY5Y+human+neuroblastoma+cells+increases+%5BCa2%2B%5Di+initiates+neurotransmitter+release+and+promotes+delayed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Activation of recombinant human TRPV1 receptors expressed in SH-SY5Y human neuroblastoma cells increases [Ca2+]i initiates neurotransmitter release and promotes delayed cell death.</a> J Neurochem. 102 (3), 801-811 (2007).</li>
<li>Koplas, P. A., Rosenberg, R. L., Oxford, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+calcium+in+the+desensitization+of+capsaicin+responses+in+rat+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of calcium in the desensitization of capsaicin responses in rat dorsal root ganglion neurons.</a> J Neurosci. 17 (10), 3525-3537 (1997).</li>
<li>Tominaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cloned+capsaicin+receptor+integrates+multiple+pain-producing+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The cloned capsaicin receptor integrates multiple pain-producing stimuli.</a> Neuron. 21 (3), 531-543 (1998).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>חומצה רטינואית All-trans</td><td>Tocris</td><td>695</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Tocris</td><td>TOCR-2837</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3795</td><td></td></tr><tr><td>פרפר מסוג 23GA סטרילי</td><td>Beckton Dickinson Asepto</td><td>38833814</td><td>סט ורידים בקרקפת</td></tr><tr><td>Capsaicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2028</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td></td><td>12500062 בסיסי בינוני</td></tr><tr><td>D-ריבוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7500</td><td></td></tr><tr><td>D-threose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7392</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8 ערכת בדיקת שטף סידן</td><td>Abcam</td><td>ab112129</td><td>ללא שטיפה</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי מושבת בחום</td><td>Gibco</td><td>A5670801</td><td></td></tr><tr><td>תכולה גבוהה הקרנה&nbsp;</td>מכשירים <td></td><td></td><td>מולקולריים</td></tr><tr><td>תוכנת LASX</td> תוכנת <td>מיקרוסקופיה</td><td>Leica TCS</td><td></td></tr><tr><td>SP8</td><td>Leica Microsystems Leica</td><td>TCS SP8</td><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140130</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי (35/10 מ"מ)</td> <td>גריינר ביו-אחד</td><td>627965</td><td></td></tr><tr><td>זנב חולדה סוג I קולגן</td><td>קורנינג</td><td></td><td></td>354236</tr><tr><td>SH-SY5Y</td><td>Merck</td><td>94030304-1VL</td><td>קו תאים נוירובלסטומה</td></tr></tbody></table>

תוצרי קצה מתקדמים של גליקציה מרגישים תאי עצב דמויי חישה אנושיים לזרם סידן המושרה על ידי קפסאיצין

Advanced Glycation End-Products Sensitize Human Sensory-Like Neuron Cells to Capsaicin-Induced Calcium Influx

התמיינות תאי SH-SY5Y לנוירון דמוי חושי תמונות הקרנה בעלות תוכן גבוה מדגימות כי פרוטוקול ההתמיינות העצבית משנה את המורפולוגיה של תאי SH-SY5Y. תאי העצב דמויי החישה (תאים מובחנים) מציגים גוף תאים מעוגל שמקרין רשת נרחבת של נוירופילמנטים. הם יוצרים ענפים של הקרנות נויריט מוארכות יותר שמחברות את תאי העצב שמסביב, מה שעולה בקנה אחד עם תכונות של תאי עצב בוגרים (איור 3)4. חשוב לציין, תאים אלה מציגים רמות מוגברות של TRPV1 בהשוואה לתאי SH-SY5Y לא ממוינים (<str...

Increased collagen-derived advanced glycation end products (AGEs) are consistently linked to painful diseases, including osteoarthritis, diabetic ...

advanced-glycation-end-products-sensitize-human-sensory-like-neuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בדיקת הכף הקרה (CPA) מודדת היענות לקור בין 30 מעלות צלזיוס ל-5 מעלות צלזיוס, ויכולה גם למדוד הסתגלות לקור. פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש ב-CPA כדי למדוד רגישות יתר לקור, שיכוך כאבים והסתגלות בעכברים.

שיטה פשוטה וזולה לקביעה קרה רגישות והסתגלות בעכברים

כתב יד זה מתאר כיצד להכין גרעיני שורש גב שלמים להקלטות מהדק טלאי. תכשיר זה שומר על המיקרו-סביבה עבור נוירונים ותאי גליה לווייניים, ובכך נמנע מהשינויים הפנוטיפיים והתפקודיים הנראים באמצעות נוירוני DRG מנותקים.

הצמד תיקון הקלטות על Intact השורש הגבי הגרעינים מן חולדות בוגרות

מחקר זה יוצר מודל ניסיוני של נוירופתיה טהור סיבים קטנים עם resiniferatoxin (RTX). מנה ייחודית של RTX (50 µg/kg) היא אופטימלית לפיתוח מודל נוירופתיה סיבים קטנים המחקה מאפייני המטופל יכול לעזור לחקור את המשמעות nociceptive המולקולרי שבבסיס כאב נוירופתי.

הקמת מודל העכבר של נוירופתיה סיבים קטנים טהור עם אגוניסט Ultrapotent פוטנציאלי קולטן ארעי Vanilloid סוג 1

כאן אנו מציגים כיצד לחשוף את גנגליון geniculate של עכבר מעבדה חי, מרדים וכיצד להשתמש הדמיית סידן כדי למדוד את התגובות של הרכבים של נוירונים אלה לטעום גירויים, המאפשר ניסויים מרובים עם ממריצים שונים. זה מאפשר השוואות מעמיקות של אילו נוירונים מגיבים לאו תיוהמים.

In vivo סידן הדמיה של עכבר גניציה גנגליון נוירון תגובות לגירויים טעם

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את מודל שחרור הפפטיד הקשור לגן ex vivo calcitonin (CGRP) ואת האסטרטגיה לכמת את ההשפעה של חומרים פרמקולוגיים על כמות CGRP המשתחררת מהמערכת הטריגמינווסקולרית במכרסמים.

אקס ויוו שחרור פפטיד הקשור לגן קלציטונין ממערכת Trigeminovascular במכרסמים

פרוטוקול זה מתאר את החשיפה הכירורגית של גנגליון השורש הגבי (DRG) ואחריו GCaMP3 (אינדיקטור Ca2+ מקודד גנטית; חלבון פלואורסצנטי ירוק-קלמודולין-M13 חלבון 3) Ca2+ הדמיה של הרכבים עצביים באמצעות עכברי Pirt-GCaMP3 תוך הפעלת מגוון גירויים על הכף האחורית ipsilateral.

ב Vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעיני שורש גבי שלמים

מדדי סידן מקודדים גנטית (GECI) מאפשרים ניתוח חזק ברמת האוכלוסייה של איתות נוירונים חושי. כאן, פיתחנו גישה חדשנית המאפשרת הדמיית GECI in vivo של פעילות גרעיני גרעינים של חולדות.

In-Vivo הדמיית סידן של נוירונים חושיים בגנגליון טריגמינלי של חולדה

מחקר זה מציג מניפולציה כירורגית לחשיפת ה-T-DRG בעכברים מורדמים לצורך הדמיית סידן in vivo , יחד עם הקלטות א.ק.ג סינכרוניות. שיטה זו מייצגת כלי חדשני לחקר גירוי עצבי חשמלי היקפי וכניסות של איברי קרביים של בית החזה, כמו גם האינטראקציות ביניהם ברמה החושית הראשונית.

In vivo Thoracic Horsal Root Ganglia (DRG) הדמיית סידן והקלטת א.ק.ג לחקר גירוי עצבי היקפי

מאמר זה מציג שיטה לניטור כמותי בזמן אמת של ריכוזי יוני סידן (Ca2+) בתאים באמצעות הדמיה חד-תאית Ca2+ עם צבע Fura-2/AM. טכניקה זו מאפשרת העמסת צבע יעילה וחישוב מדויק של רמות Ca2+ באמצעות יחסי עוצמת פלואורסצנטיות, מה שהופך אותה לגישה פשוטה ומהירה ליישומי מחקר.

דימות סידן חד-תאי לחקר הפעלת תעלות יוני סידן

פרוטוקול זה מתאר הדמיית סידן in vivo GCaMP של נוירונים שלמים של גנגליון טריגמינלי (TG). תיאור זה כולל ניתוח חשיפה ל-TG, הדמיית מיקרוסקופיה קונפוקלית in vivo של נוירונים TG, יישום גירויים סומטיים במהלך הדמיה מיקרוסקופית של נוירונים TG וניתוח נתוני הדמיית סידן in vivo GCaMP.

ב Vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעינים טריגמינליים שלמים

חקור כיצד גליקציה של קולגן מגבירה רגישות תאי עצב דמויי חישה לקפסאיצין באמצעות מדידת זרם סידן. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לבחון מנגנוני כאב ומטרות מולקולריות במחלות ניווניות.

תוצרי קצה מתקדמים של גליקציה מרגישים תאי עצב דמויי חישה אנושיים לזרם סידן המושרה על ידי קפסאיצין

גלה סרטונים נוספים