הרכבה מודולרית סטנדרטית של אופרון פוליציסטרוני עם שיבוט מודולרי (MoClo) באמצעות ערכת הכלים In-Cloning

פיתחתי שיטות שמאפשרות הרכבת DNA מודולרית מחלקים מולקולריים קטנים ועד למבנים בגודל כרומוזומים, ולתכנת מחדש תאים עם הכרומוזומים המלאכותיים הללו. חידוש חשוב בתחום הוא פיתוח ערכות כלים לשיבוט מודולריות המאפשרות הרכבה מודולרית של מבנים רב-גנים מתוך ספריית חלקים מולקולריים סטנדרטיים. ערכות כלים לשיבוט מודולרי מיועדות בדרך כלל לשכפל יחידות שעתוק מונוציסטרוניות.

פרוטוקול זה מדגים דרך הכללית להרכבת יחידות שעתוק פוליציסטרוניות עם ערכת הכלים לשיבוט פנימי. אסטרטגיה זו של שיבוט יחידת שעתוק פוליציסטרונית מאפשרת שימוש גמיש ברצפי קידוד ביחידת שעתוק בודדת או בסידורים פוליציסטרוניים. כדי להתחיל, בחר את חלקי רמה 0 שיש להרכיבם ליחידת תמלול.

אלה חייבים לכלול לפחות RBS, רצף קידוד וטרמינטור. בחר את המיקום שבו יחידת התמלול תורכב באופרון. בהתבסס על המיקום שנבחר, בחר את הפלסמיד המקבל המתאים וסימולציה של הרכבת גולדן גייט ב-SnapGene.

בתגובת גולדן גייט, השתמשו באנזים SAP1 כדי לשחרר את אתר הקישור של הריבוזום, רצף הקידוד והטרמינטור מהפלסמידים המתאימים שלהם ולחתוך את הפלסמיד המקבל. הרכיבו את אתר הקישור של הריבוזום, רצף הקידוד והטרמינטור לפלסמיד מקבל החיתוך. לאחר מכן בתגובת גולדן גייט, השתמשו בפיפטה כדי להוסיף 50 פמטומולים מכל אינסרט רצוי ו-50 פמטומולים של פלסמיד המקבל.

מיקרוליטר אחד מכל אחד מ-10x DNA ליגאז, ליגאז T4 ו-SAP1 לצינור תגובה. לאחר מכן מוסיפים מים נטולי נוקלאז כדי להביא את הנפח הסופי ל-10 מיקרוליטר. שים את הצינור בתרמוסייקלר.

הרץ 25 מחזורים של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות, 16 מעלות צלזיוס לארבע דקות, ו-50 מעלות צלזיוס ל-20 דקות. לאחר מכן בחימום משבית את האנזימים ב-80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. באופן אופציונלי, יש פיפטה של 0.5 מיקרוליטר של SAP1 לתגובה של GG ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.

חמישה מיקרוליטרים מהתגובה מתערבבים ל-50 מיקרוליטר של תאי E.coli מיומנים כימית. בצע טרנספורמציה של הלם חום על ידי הטלת הצינור באמבט מים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ואז מניחים את הצינור על קרח למשך שתי דקות. לאחר מכן, דגרו את התאים במיליליטר אחד של מדיה למשך שעה כדי לסייע בהתאוששות.

צלחת 100 מיקרוליטר של הטרנספורמציה התפתחה על צלחת מקדחה LB המכילה 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין. דגרו את הצלחת בלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. למחרת, בחרו שתי מושבות לבנות באמצעות לולאת חיסון או קצה פיפטה.

החסן כל אחד לחמישה מיליליטר של מדיום LB המכיל 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין. דגרו לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתנור רועד במהירות של 250 סיבובים לדקה. בצע חילוץ משובצות לפי הוראות היצרן.

לעכל מיקרוגרם אחד של DNA פלזמה שהופק על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של 10x בופר עיכול ומיקרוליטר אחד של BBS1. הוסיפו מים ללא נוקלאז כדי להגיע לנפח הכולל ל-10 מיקרוליטרים ולדגר. עכשיו טען את הפלסמיד המעכל על ג'ל 1% אגרוז והפעל אלקטרופורזה ב-100 וולט למשך 35 דקות.

לאחר מכן צילם את הג'ל ואשר את ההרכבה הנכונה של הפלסמיד. כדי להרכיב מבנה רמה M, בחרו את יחידות השעתוק ברמה 1 שיש להרכיב. סימולציה של מכלול גולדן גייט על ידי שחרור יחידות השעתוק הראשונה והשנייה ואת המקשר הסופי באמצעות האנזים BBS1.

במקביל, חותכים את פלסמיד המקבל, ואז מרכיבים את שלושת החלקים לפלסמיד המקבל ליצירת יחידת השעתוק הפוליציסטרונית. הבקרה השלילית להרכבת פלסמיד רמה 1, שלא כללה חלק טרמינטור, לא הניבה מושבות, בעוד שהתגובה המלאה הניבה 292 מושבות לבנות וללא מושבות אדומות. הרכבת המבנה הרב-גנטי ללא הקסטה השנייה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס הניבה רק שתי מושבות לבנות, בעוד שההרכבה המלאה הניבה תשע מושבות גדולות ו-435 מושבות קטנות.

בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, הבקרה השלילית להרכבת רב-גנים הניבה ארבע מושבות לבנות, בעוד שהתגובה המלאה הניבה יותר מ-1,500 מושבות. דיגסט BSA1 של פלסמיד המקבל PMA60 נותן את התחום היחיד הצפוי ב-5,500 זוגות בסיסים. עיכול BSA1 של פלסמידים מ-24 מושבות גילה ש-23 מתוך 24 הראו דפוס הגבלה נכון של שני רצועות בכ-4,300 זוגות בסיסים ו-1,700 זוגות בסיסים.

הדמיית פלואורסצנציה הראתה פלואורסצנציה ירוקה וציאנית חזקה במושבות מפלטות המכילות את משרה OC6, בעוד שפלטות ללא מעורר הראה פלואורסצנציה מינימלית או ללא פלואורסצנציה.