Name: הרכבה מודולרית סטנדרטית של אופרון פוליציסטרוני עם שיבוט מודולרי (MoClo) באמצעות ערכת הכלים In-Cloning (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: למדו את פרוטוקול הרכבת אופרונים פוליציסטרוניים באמצעות שיבוט מודולרי (MoClo) עם ערכת In-Cloning. שיטה זו מאפשרת הרכבת יחידות שעתוק רב-גניות מחלקים מולקולריים סטנדרטיים לחקר הנדסה גנטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>James, J. S., Dai, J., Chew, W. L., Cai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+and+engineering+of+synthetic+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The design and engineering of synthetic genomes.</a> Nat Rev Genet. 1, 1-22 (2024).</li>
<li>Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+cloning+system+for+standardized+assembly+of+multigene+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs.</a> PLoS One. 6 (2), e16765(2011).</li>
<li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PLoS One. 3 (11), e3647(2008).</li>
<li>Pingoud, A., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+type+II+restriction+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structure and function of type II restriction endonucleases.</a> Nucleic Acids Res. 29 (18), 3705-3727 (2001).</li>
<li>Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golden+Gate+shuffling%3A+A+one-pot+DNA+shuffling+method+based+on+type+IIs+restriction+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Golden Gate shuffling: A one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes.</a> PLoS One. 4 (5), e5553(2009).</li>
<li>de Vries, S. T., Kley, L., Schindler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+Golden+Gate+plasmid+set+enabling+scarless+MoClo-compatible+transcription+unit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Golden+Gate+Cloning%3A+Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Use of a Golden Gate plasmid set enabling scarless MoClo-compatible transcription unit assembly.</a> Golden Gate Cloning: Methods Protoc. 2850, 105-132 (2024).</li>
<li>de Vries, S. T., Köbel, T. S., Sanal, A., Schindler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-%26+Out-Cloning%3A+Plasmid+toolboxes+for+scarless+transcription+unit+and+modular+Golden+Gate+acceptor+plasmid+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">In-& Out-Cloning: Plasmid toolboxes for scarless transcription unit and modular Golden Gate acceptor plasmid assembly.</a> Synth Biol. 9 (1), ysae016(2024).</li>
<li>Schindler, D., Milbredt, S., Sperlea, T., Waldminghaus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+assembly+of+DNA+sequence+libraries+for+chromosomal+insertion+in+bacteria+based+on+a+set+of+modified+MoClo+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Design and assembly of DNA sequence libraries for chromosomal insertion in bacteria based on a set of modified MoClo vectors.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1362-1368 (2016).</li>
<li>Zumkeller, C., Schindler, D., Felder, J., Waldminghaus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+assembly+of+synthetic+secondary+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Bacterial+Chromatin%3A+Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Modular assembly of synthetic secondary chromosomes.</a> Bacterial Chromatin: Methods Protoc. 2819, 157-187 (2024).</li>
<li>Hoffmann, S. A. YeastFab cloning of toxic genes and protein expression optimization in yeast. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoffmann%2C+SA+%22Golden+Gate+Cloning%3A+Methods+and+Protocols%22">Golden Gate Cloning: Methods and Protocols</a>. , Springer, New York. (2025).</li>
<li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-evaluation+of+E.+coli%27s+operon+structures+via+a+whole-cell+model+suggests+alternative+cellular+benefits+for+low-+versus+high-expressing+operons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Cross-evaluation of E. coli's operon structures via a whole-cell model suggests alternative cellular benefits for low- versus high-expressing operons.</a> Cell Syst. 15 (3), 227-245.e7 (2024).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+stoichiometry+control+of+bacterial+operons+revealed+by+deep+proteome+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Multifaceted stoichiometry control of bacterial operons revealed by deep proteome quantification.</a> Front Genet. 10, 1-12 (2019).</li>
<li>Müntjes, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+polycistronic+expression+in+the+model+microorganism+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Establishing polycistronic expression in the model microorganism Ustilago maydis.</a> Front Microbiol. 11, 1-10 (2020).</li>
<li>Behrendt, G., Frohwitter, J., Vlachonikolou, M., Klamt, S., Bettenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymo-Parts%3A+A+Golden+Gate+modular+cloning+toolbox+for+heterologous+gene+expression+in+Zymomonas+mobilis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Zymo-Parts: A Golden Gate modular cloning toolbox for heterologous gene expression in Zymomonas mobilis.</a> ACS Synth Biol. 11 (11), 3855-3864 (2022).</li>
<li>Green, R., Rogers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+transformation+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Chemical transformation of E. coli.</a> Methods Enzymol. 529, 329-336 (2013).</li>
<li>Köbel, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+easy-to-use+plasmid+toolset+for+efficient+generation+and+benchmarking+of+synthetic+small+RNAs+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">An easy-to-use plasmid toolset for efficient generation and benchmarking of synthetic small RNAs in bacteria.</a> ACS Synth Biol. 11 (9), 2989-3003 (2022).</li>
<li>Meyer, A. J., Segall-Shapiro, T. H., Glassey, E., Zhang, J., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+%26%2334%3BMarionette%26%2334%3B+strains+with+12+highly+optimized+small-molecule+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli &#34;Marionette&#34; strains with 12 highly optimized small-molecule sensors.</a> Nat Chem Biol. 15 (2), 196-204 (2019).</li>
<li>Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+design+of+synthetic+ribosome+binding+sites+to+control+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression.</a> Nat Biotechnol. 27 (10), 946-950 (2009).</li>
<li>Chen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+582+natural+and+synthetic+terminators+and+quantification+of+their+design+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints.</a> Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).</li>
<li>Togna, A. P., Shuler, M. L., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+plasmid+copy+number+and+runaway+plasmid+replication+on+overproduction+and+excretion+of+beta-lactamase+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Effects of plasmid copy number and runaway plasmid replication on overproduction and excretion of beta-lactamase from Escherichia coli.</a> Biotechnol Prog. 9 (1), 31-39 (1993).</li>
<li>Messerschmidt, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+characterization+of+the+synthetic+secondary+chromosome+synVicII+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optimization and characterization of the synthetic secondary chromosome synVicII in Escherichia coli.</a> Front Bioeng Biotechnol. 4, 1-9 (2016).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>אמפיצילין</td><td>מרק לייף סיינס</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>אגר חיידקי</td><td>פישר סיינטיפיק &nbsp;</td><td>P0011B</td><td></td></tr><tr><td>BbsI-HF</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>R3539</td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF V2</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>R3733</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH5&alpha; תאים מיומנים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אפנדורף&nbsp; Mastercycler&nbsp; Nexus Thermal Cyclers</td><td>אפנדורף</td><td>6333000014</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר EzDrop 1000 מיקרו-נפח</td><td>בלו-ריי ביוטק</td><td>BRED-1000</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיני-פרפ של פלסמיד GeneJET</td><td>תרמו-סיינטיפיק</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>in- & Out- ערכת כלים לשיבוט</אם></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>בופר ליגזה</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>B0216</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>פישר סיינטיפיק &nbsp;</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>ניו ברונסוויק אינובה ורג; &nbsp; 42/42R - מנער אינקובטור ניתן לערימה</td><td>אפנדורף</td><td>M1335-0080</td><td></td></tr><tr><td>PhenoBooth+</td><td>Singer Instruments</td><td>PHB-007</td><td></td></tr><tr><td>SapI</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>R0569</td><td></td></tr><tr><td>ספקטינומיצין</td><td>מרק לייף סיינס</td><td>S4014</td><td></td></tr><tr><td>מעבדה סטנדרטית</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ליגאז DNA של T4</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>תרמומיקס MM</td><td>ב. בראון ביוטכנולוגיה אינטרנשיונל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טריפטון</td><td>פישר סיינטיפיק &nbsp;</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>פישר סיינטיפיק &nbsp;</td><td>LP0021B</td><td></td></tr></tbody></table>

הרכבה מודולרית סטנדרטית של אופרון פוליציסטרוני עם שיבוט מודולרי (moclo) באמצעות ערכת הכלים in-cloning

Standardized Modular Assembly of Polycistronic Operons with Modular Cloning (MoClo) using the In-Cloning toolkit

הרכבה מודולרית סטנדרטית של אופרון פוליציסטרוני עם שיבוט מודולרי (MoClo) באמצעות ערכת הכלים In-Cloning

Modular Cloning (MoClo) toolkits enable the rapid assembly of multigene constructs. They are based on Golden Gate cloning, which uses Type IIS restriction ...

standardized-modular-assembly-polycistronic-operons-with-modular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

סרטון זה מתאר את BiFC-PALM - שילוב של מיקרוסקופ לוקליזציה פוטואקטיבי והשלמה פלואורסצנטית דו-מולקולרית - כדי להעריך אינטראקציות חלבון-חלבון. BiFC כרוך באיחוי של שני מקטעי חלבון פלואורסצנטיים עם שני חלבונים בעלי אינטראקציה. כאשר שני החלבונים מתקשרים, המקטעים מובאים לקרבה, מה שמאפשר לשני החלקים להתאחד וליצור מחדש חלבון פלואורסצנטי פונקציונלי. הפלואורסצנטיות של פלואורופור יחיד ממוקמת ברמת מולקולה בודדת בתוך תאים על ידי PALM.

מיקרוסקופ לוקליזציה פוטואקטיבי מצומד פלואורסצנטי דו-מולקולרי

קומפלקסי חלבונים לזרז תפקודים תאיים מרכזיים. אפיון פונקציונלי והמבני מפורט של מתחמים רבים חיוניים דורש ייצור רקומביננטי. MultiBac הוא מערכת תא baculovirus / חרק מותאם במיוחד לביטוי חלבונים אוקריוטים והמתחמים שלהם. MultiBac יושם כפלטפורמת גישה פתוחה, ונהלי עבודה סטנדרטיים שפותחו על מנת למקסם את התועלת שלו.

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

סינתזה של פלסמידים מותאמים אישית גוזלת עבודה וזמן. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בשיבוט הרכבה של גיבסון כדי להפחית את העבודה ומשך הליך שיבוט ה-DNA המותאם אישית. הפרוטוקול המתואר מייצר גם מבני חלבון מתויגים אמינים לביטוי יונקים בעלות דומה לשיבוט ה-DNA המסורתי של גזירה והדבקה.

דור של פלסמיד וקטורים לבטא חלבונים מתויג FLAG על פי תקנות ההסדרה של יזם אדם התארכות Factor-1α שימוש גיבסון עצרת

אינטראקציות חלבון-חלבון מוצגות בתאים עם רזולוציה מרחבית ננומטרית על ידי שילוב של השלמת פלואורסצנטיות דו-מולקולרית (BiFC) עם מיקרוסקופ לוקליזציה פוטו-אקטיבי (PALM). מתואר כאן השימוש ב-BiFC-PALM להדמיית אינטראקציות Ras-Raf בתאי U2OS להמחשת אשכולות ודיפוזיה בקנה מידה ננומטרי של קומפלקסים בודדים של Ras-Raf.

Photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופית עם bimolecular פלואורסצנטי השלמה (BiFC-PALM)

אנו מתארים מערכת ביצית Xenopus וכובע בעלי חיים לשיבוט ביטוי של גנים המסוגלים לעורר תגובה באקטודרם מוכשר, ודנים בטכניקות לניתוח מאוחר יותר של גנים כאלה. מערכת זו שימושית בזיהוי פונקציונלי של מגוון רחב של תוצרי גנים.

שיבוט פונקציונלי שימוש<em&gt; Xenopus</emמערכת ביטוי ביצית&gt;

. הנה, זרימת עבודה אוטומטית לבצע הרכבה "התקן" DNA מודולרי, באמצעות שיטה מודולרית DNA שיבוט הרכבה על רובוטים נוזלי-טיפול מוצג. הפרוטוקול משתמשת כלי תוכנה אינטואיטיבית ליצירת רשימות המטפל נוזלי לדור קומבינטורית DNA התקן הספרייה, אשר נדגים באמצעות שתי פלטפורמות טיפול בנוזלים.

אוטומטית רובוטית טיפול בנוזלים הרכבה של התקנים DNA מודולרי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר כיצד אני) להרכיב וקטור שכפול עצמי באמצעות ערכת השכפול שיבוט מודולרי ציאנוגייט, ii) להציג את הווקטור לתוך מארח cyanobacterial על ידי הקונקטורים, ו iii) לאפיין את הזנים של הציטוחיידקים הטרנסגניים באמצעות קורא צלחת או לזרום cy, לנסות.

השינוי הגנטי של הקיאובקטריה באמצעות הקוניוגציה באמצעות ערכת השכפול המודולרי של ציאנוגייט

מטרת פרוטוקול זה היא לספק מדריך מפורט, צעד אחר צעד להרכבת מבנים מרובי גנים באמצעות מערכת שיבוט מודולרית המבוססת על שיבוט שער הזהב. הוא גם נותן המלצות על צעדים קריטיים כדי להבטיח הרכבה אופטימלית המבוססת על החוויות שלנו.

הרכבה מהירה של מבנים מרובי גנים באמצעות שיבוט שער הזהב מודולרי

המחקר מתאר פרוטוקול ליצירת כמויות גדולות (מיקרוגרם-מ"ג) של DNA עבור קמפיינים הקרנת חלבונים מרסיסי גנים סינתטיים ללא שיבוט או שימוש בתאים חיים. התבנית המינימלית מתעכלת באופן אנזימטי ומעגלית ולאחר מכן מוגברת באמצעות הגברה איזותרמית מתגלגלת של מעגל. תגובות חופש התא יכול להתבצע עם המוצר שלא שאושר.

שיטות מהירות ואנזימטיות להגברה של תבניות ליניאריות מינימליות לאבן טיפוס של חלבונים באמצעות מערכות נטולות תאים

מודול שיבוט מולקולרי של Gibson Assembly הניתן להתאמה הועסק בפורמט ניסיון מחקרי לתואר ראשון (CURE) מבוסס קורס לתלמידי קורס מעבדה לביולוגיה מולקולרית. הערכת תוצאות הלמידה של התלמידים הראתה שיפור בהבנה ובביטחון בשיבוט מולקולרי לאחר השלמת CURE, ופלסמידים חדשים שובטו למחקר ביוסינתזה של מוצרים טבעיים.

שיפור תוצאות התלמידים עם ניסיון מחקר לתואר ראשון המבוסס על קורס שיבוט מולקולרי ניתן להתאמה

למדו את פרוטוקול הרכבת אופרונים פוליציסטרוניים באמצעות שיבוט מודולרי (MoClo) עם ערכת In-Cloning. שיטה זו מאפשרת הרכבת יחידות שעתוק רב-גניות מחלקים מולקולריים סטנדרטיים לחקר הנדסה גנטית.

הרכבה מודולרית סטנדרטית של אופרון פוליציסטרוני עם שיבוט מודולרי (MoClo) באמצעות ערכת הכלים In-Cloning

גלה סרטונים נוספים