בידוד ותרבית של תאי מולר רשתית ראשוניים מחולדות Sprague-Dawley (SD)

פרוטוקול זה מתאר בידוד ותרבית של תאי מולר ראשוניים ברשתית מחולדות Sprague-Dawley SD, שיכולים לסייע למחקר הרשתית בקהילה המדעית. הפרוטוקול מכסה, דיסקציה של הרשתית, חילוץ וזיהוי שתל שבלול ושיקולי בקרה מרכזיים. פרוטוקול זה קובע שיטה יעילה, סטנדרטית וחסכונית לחילוץ ושחזור RMC ממדפי ה-SD החוקיים שלך. ניתן להשתמש במודל RMC כדי לדמות מצבים פתולוגיים כגון סוכרת, הנורמליות ולסייע בהשפעות התרופות.

[קריין] כדי להתחיל, שפכו את התמיסה של D-Hank לשתי צלחות תרבית זכוכית של 10 סנטימטרים. לאחר המתת חסד וחיטוי של חולדת SD שזה עתה נולדה, הניחו אותה על צלחת מעוקלת סטרילית. בעזרת פינצטה, קרעו את עור העפעפיים לאורך הסדק הפלפברלי כדי לחשוף את גלגל העין של החולדה. החזק פינצטה חסרת שיניים פתוחה ומקבילה לסדק הפלפברלי כדי ללחוץ כלפי מטה על המסלול. לאחר שמגיעים לעצב הראייה וגלגל העין נחשף, סגור את הפינצטה כדי להרים ולחלץ את גלגל העין. כעת הניחו את גלגל העין בצלחת תרבית זכוכית עם הפתרון של D-Hank. שטפו את גלגל העין והעבירו אותו לכלי אחר עם תמיסה טרייה של D-Hank. לאחר מכן בעזרת מיקרו מלקחיים עיניים מעוקלים, קבע בעדינות את האזור שבין הקרנית לעצב הראייה כדי לחשוף את הקרנית. חודרים את צומת הקרנית בעזרת מספריים מיקרו קרנית וחותכים לאורך הלימבוס בצורה מעגלית. בצע שני חתכים סקלרליים סימטריים באורך של כשני מילימטרים לפני שחרור המלקחיים וההידוק מחדש בצומת עצב הראייה והסקלרה. לאחר מכן, השתמש במלקחיים שניים כדי ללחוץ בעדינות ליד שורש עצב הראייה המכוון לחץ לכיוון ממשק עצב הראייה בקרנית. כאשר רקמת העדשה מופיעה, הסר אותה בזהירות והמשך ללחוץ עד להופעת רקמת הרשתית. בעזרת מלקחיים מעבירים את רקמת הרשתית המופרדת לצלחת תרבית סטרילית אחרת. פתח את מכסה צלחת התרבות והשתמש בפיפטה עם קצה מיליליטר אחד כדי לזרוק את רקמת הרשתית למעלה ולמטה כ -15 פעמים כדי לשבור אותה לחתיכות קטנות. לאחר מכן, דגרו על הרקמה עם מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. מוציאים את צלחת התרבות מהחממה ומניחים אותה על הספסל הנקי. הוסף שני מיליליטר של מדיום שלם ופיפטה בעדינות כדי לעצור את העיכול. כעת סנן את מתלה התא דרך מסך ניילון 300 רשת לצנטריפוגה 15 מיליליטר שתיים. שוטפים את צלחת התרבות עם PBS מוכן ואוספים את המתלה שנותר. ואז סובב את הצינור בחום של 878 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, יש לשאוף ולהשליך את הסופרנטנט. השעו מחדש את הגלולה בשני מיליליטר של מדיום שלם וצנטריפוגה שוב ב-878 גרם למשך חמש דקות כדי לטהר את התאים. לאחר השלכת הסופרנטנט יש להשעות את התאים בשני מיליליטר של מדיום שלם. קח בקבוק T25 עם שלושה מיליליטר של מדיום שלם והוסף מיליליטר אחד של מתלה התאים. נענע את הבקבוק בתבנית צלב לפני שמכניסים אותו לחממה. לאחר 48 שעות דגירה, הוציאו את הבקבוק מהחממה והניחו אותו על הספסל הנקי. השליכו את המדיום המושקע ושטפו את המשטח הדבק לתא שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS, המכיל 1% פניצילין בתוספת סטרפטומיצין. לאחר מכן מוסיפים חמישה מיליליטר של מדיום טרי ושלם, וממשיכים בדגירה עד שמפגש התאים עולה על 90%. שטפו את התאים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS המכיל 1% פניצילין סטרפטומיצין. לאחר מכן דגרו על התאים עם מיליליטר אחד של תמיסת EDTA של 0.25% טריפסין למשך דקה ו-30 שניות. כעת, התבונן בבקבוק תחת מיקרוסקופ הפוך. כאשר התאים נראים עגולים, מנותקים ומתחילים לצוף, הוסף שני מיליליטר של מדיום תרבית שלם לבקבוק כדי לסיים את העיכול. לאחר מכן השתמש בפיפטה כדי לשאוב את תרחיף התא ולהעביר את כל תרחיף התא לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. שוטפים את דופן הבקבוק בשני מיליליטר PBS המכילים 1% סטרפטומיצין פניצילין, ומוסיפים אותו לאותו צינור. צנטריפוגה את הצינור ב 878 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא בנפח מתאים של מדיום שלם. לבסוף, העבירו את התאים ביחס של אחד לשניים או אחד לשלושה, לפי הצורך. מעבר שני: תאי מולר ברשתית או RMCs הציגו מורפולוגיות בצורת כוכב או ציר עם גרעינים עגולים או סגלגלים וציטופלזמה בשפע. צביעת המטוקסילין ואאוזין חשפה תאים בצורת ציר וכוכב עם ציטופלזמה ורודה בשפע וגרעינים סגלגלים הממוקמים במרכז המחוברים ביניהם על ידי מבנים חוטיים עדינים. צביעה אימונופלואורסצנטית של RMCs חשפה פלואורסצנטיות אדומה חזקה בתאים המסומנים עבור גלוטמין סינתטאז ואקוופורין-4 ופלואורסצנציה ירוקה בהירה עבור CRALBP, Kir4.1 ווימנטין. NeuN, הבקרה השלילית לא זוהתה בניתוח אימונופלואורסצנטי המאשר את הספציפיות של בידוד RMC. ניתוח זרימה ציטומטרי הראה כי 98.7% מהתאים היו חיוביים לגלוטמין סינתטאז ו-97% היו חיוביים ל-CRALBP, מה שמעיד על טוהר גבוה של ה-RMC.