קביעת מורפולוגיה מיטוכונדריאלית בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

המחקר שלנו מתמקד בנוירו-פרמקולוגיה בסיסית. באופן ספציפי, אנו חוקרים כיצד מולקולות של תרופות פועלות. אנו שואפים להבין את הקשר בין תרכובות תרופות פוטנציאליות לתפקוד המיטוכונדריה במחלת פרקינסון.

מחקרים קודמים סוקרים אתגרים ארוכי טווח של ניתוח תאי מעבדה אפילו עם הנחיות היצרן. כדי לפתור זאת, תיארנו פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב להערכת מורפולוגיה מיטוכונדריאלית בתאי מעבדה. הפרוטוקול שלנו משתמש בכתמים מיטוכונדריאלים פשוטים, הדמיה פלואורסצנטית ותוכנת קוד פתוח.

זה מפחית עלויות, מגביר את הנגישות ומקל על השימוש מאשר חלופות מורכבות כמו מיקרוסקופ אלקטרונים. כדי להתחיל, השג תרביות של תאי SH-SY5Y הגדלים בצלוחיות המכילות DMEM/F12, בתוספת 10% FBS. נתק את התאים למשך דקה אחת באמצעות תמיסת טריפסין של 0.05%.

לאחר מכן צנטריפוגה את התאים ב-100 גרם למשך שלוש דקות לפני המעבר. לאחר מכן, השעו את תאי SH-SY5Y במדיום DMEM/F12 בתוספת 1% FBS. לאחר מכן זרעו את התאים על כלים קונפוקליים עם תחתיות זכוכית ושמרו אותם למשך הלילה.

עבור MPP+גירוי, החלף את מדיום התרבות במדיום טרי עם או בלי 1-מתיל-4-פנילפירידיניום למשך 24 שעות. לצביעה של MitoTracker, יש לדלל את תמיסת המלאי של MitoTracker עם מדיום DMEM/F12 מחומם מראש כדי לקבל ריכוז עבודה של 50 ננו-מולארי. שמור על תמיסת הצביעה מוגנת מפני אור לאורך כל ההליך.

הסר את מדיום התרבות מהכלים הקונפוקליים. שטפו את התאים פעמיים עם DMEM/F12 טרי. ואז פיפטה מיליליטר אחד של תמיסת העבודה MitoTracker לתוך הצלחת.

דוגרים במשך 15 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס בחושך. כעת הסר את פתרון העבודה של MitoTracker ושטוף את הכלים פעמיים עם DMEM/F12. לאחר הכביסה האחרונה, הוסף מיליליטר אחד של DMEM/F12 לכל מנה.

דגירה בחממת התאים לפני ההדמיה. כדי לאזן מראש את המיקרוסקופ הקונפוקלי להדמיה, תחת לוח הרכישה, התאם את פרמטרי נתיב האור על ידי הגדרת אורכי גל העירור והפליטה. הגדר את גודל חור הסיכה ל-1.2 יחידות אווריריות, גודל סריקת פיקסלים ל-1024 על 1024, זמן השתהות פיקסלים ל-2.4 מיקרו-שניות עם ממוצע של שתיים.

כעת השתמש באור הלוגן כדי להתמקד בתאים באמצעות עדשת אובייקטיבית אפוכרומטית 60X עם צמצם מספרי של 1.4, מה שממזער את הפוטוטוקסיות. כוונן את עוצמת הלייזר ואת המתח הגבוה ממש מתחת לרמת הרוויה. לאחר מכן הגדר את גורם הזום לשלוש וצלם את התמונות.

הזיזו את אזור העניין כדי להתמקד בתאים אחרים מתחת למיקרוסקופ. לאחר מכן צלם תמונות מבלי לשנות הגדרות כלשהן. כדי לשפר את איכות התמונה לפני טרנספורמציה בינארית ושלד, פתח תחילה את התמונה.

בחר אזור של תא בודד באמצעות כלי החזר ההשקעה. כעת, לחץ ברצף על תהליך, מסננים, הסרת פונקציית מסכה כדי לשפר את החדות. לאחר מכן השתמש בתהליך ושפר את הניגודיות כדי להפחית את הגברת הרעש.

לחץ על התהליך, המסננים והאפשרות החציונית להסרת רעשי מלח ופלפל. כדי להמיר את התמונה לבינארית, לחץ על תהליך ואחריו בינארי ובחר באפשרות להפוך בינארית. שלד התמונה הבינארית על-ידי לחיצה על תהליך, בינארי ושלד.

לאחר מכן קבץ את כל פיקסלי השלד על ידי בחירת ניתוח, ואחריו שלד וניתוח פונקציית תלת מימד דו-ממדית של שלד. פשט את הניתוח על ידי שימוש בכלי MiNA לחישוב תשעה פרמטרים תיאוריים בתמונה השלדית. עוצמת הקרינה של צביעה מיטוכונדריאלית עלתה בהדרגה עם ריכוז CMXRos אדום של MitoTracker מ-25 ננו-מולרי ל-200 ננו-מולר.

אך ב-200 ננו-מולר, נצפתה צביעת רקע ציטופלזמית משמעותית. המורפולוגיה המיטוכונדריאלית נשמרה טוב יותר במדיום DMEM/F12 בהשוואה ל-PBS בשעה אחת לאחר הצביעה, אם כי DMEM/F12 הראה גם פלואורסצנטיות רקע גבוהה יותר. ממוצע מסגרת כפולה שיפר משמעותית את יחס האות לרעש בהדמיה מיטוכונדריאלית בהשוואה למצב סריקה בודדת.

והגדלת זמן השהייה של הפיקסלים מ-2.4 ל-10.8 מיקרו-שניות הביאה לתמונות בהירות יותר, אך גרמה להלבנת פוטו. הגדלת המתח הגבוה הגבירה את רעשי הרקע, בעוד שעוצמת הלייזר המוגברת הובילה להלבנת פוטו. הכלי MiNA ייצר פלטי שלד עקביים עבור תמונות עמומות ובהירות כאחד, מה שמצביע על פילוח חזק על פני עוצמות פלואורסצנטיות שונות, כאשר התמונה הבהירה מציגה עוצמה גבוהה פי 5.5 מהתמונה העמומה.

טיפול MPP+ב-500 מיקרו-מולרי שיבש את המורפולוגיה המיטוכונדריאלית בתאי SH-SY5Y בהשוואה לבקרה הלא מטופלת, וכתוצאה מכך טביעת רגל מיטוכונדריאלית מופחתת משמעותית.