הכנה מיטוכונדריאלית ממיקרוגליה לניתוח גליקן

באופן כללי, המחקר שלנו מתמקד בקביעת התפקיד המכניסטי של סוכרים, או גליקנים, וכיצד אנו יכולים למנף את מסלולי הגליקוזילציה התאיים והתת-תאיים הללו בהזדקנות כמו גם בהפרעות מוחיות. נכון לעכשיו, קיים פער בידע על התפקיד כמו גם האפנון של גליקנים תת-תאיים בפתופיזיולוגיות שונות של מחלות, כולל הפרעות מוח חריפות וכרוניות כמו שבץ ואלצהיימר. פרוטוקול זה והמחקר שלנו נועדו לקדם את הידע על תפקידם של גליקנים באינטראקציות נוירו-אימוניות, וכיצד ניתן למנף מידע זה כדי לתכנן טיפולים טובים ויעילים יותר במערכת העצבים המרכזית.

[קריין] כדי להתחיל, השג תאי מיקרוגליה BV-2 שמקורם בעכברי C57BL/6. שמור אותם במדיום דל גלוקוז DMEM בתוספת 10% FBS, 1% סטרפטומיצין פניצילין ו-1% חומצות אמינו לא חיוניות. גדל את התאים בצלוחיות T175 עד שהם מגיעים למפגש של 70 עד 80%. שאפו את התקשורת מהבקבוקון. השעו מחדש את כדור התא במיליליטר אחד של מצע גידול. בעזרת טריפן כחול, ספרו את התאים. צנטריפוגה את התאים בצינור מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר ב-500 גרם למשך חמש דקות. שאפו בזהירות והשליכו את הסופרנטנט. הוסף 800 מיקרוליטר של מגיב בידוד מיטוכונדריאלי A ומערבולת במהירות בינונית למשך חמש שניות. לאחר מכן דגרו את הצינור על קרח למשך שתי דקות בדיוק. הוסף 10 מיקרוליטר של מגיב בידוד מיטוכונדריאלי B ומערבולת במהירות מקסימלית למשך חמש שניות. דגירה על קרח במשך חמש דקות, מערבולת במהירות מקסימלית בכל דקה. כעת הוסף 800 מיקרוליטר של מגיב בידוד מיטוכונדריאלי C והפוך את הצינור לערבוב. וצנטריפוגה ב 700 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של שני מיליליטר וצנטריפוגה ב-3,000 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנט המכיל את החלק הציטוזולי לצינור חדש. הגלולה מכילה את המיטוכונדריה המבודדת. הוסף לגלולה 500 מיקרוליטר של מגיב בידוד מיטוכונדריאלי C, וצנטריפוגה ב -12,000 גרם למשך חמש דקות. השעו מחדש את המיטוכונדריה המבודדת ב-50 מיקרוליטר של מאגר בידוד חלבון. השאירו את המתלה על קרח למשך 20 דקות. יש לשאוב ולהוציא שלוש פעמים, ולהשאיר על קרח למשך 20 דקות, תוך מערבולת לפני השימוש. אם לא מסיס במלואו, הוסף עוד 50 מיקרוליטר של חיץ ובריכה באותו צינור. צנטריפוגה ב -13,000 גרם למשך 10 דקות. לאחר התאוששות והקפאת הסופרנטנט, יש לייבש באמצעות רכז ואקום. לזיהוי גליקנים משוחררים, השעו מחדש את הגליקנים המיובשים והמקושרים ב-50 מיקרוליטר מים בדרגת LCMS. פיפטה חמישה מיקרוליטרים של גליקנים מיטוכונדריאלים תלויים על נקודת דגימה על מגלשת מיקרובאר טפלון. יינון וזיהוי N-גליקנים במצב יינון שלילי באמצעות ממס אלקטרוספריי המורכב מ-60% אצטוניטריל וחומצה אצטית מילי-מולרית אחת בקצב זרימה של שני מיקרוליטר לדקה ומתח של 3.2 קילו-וולט. חבר IR-MALDESI לספקטרומטר מסה HRAM המוגדר בעוצמת פתרון של 240,000 רוחב מלא בחצי מקסימום ביחס מסה למטען 200 כדי לנתח בין יחס מסה למטען של 502,000 במצב יינון שלילי. זהה ידנית את הגליקנים המקושרים ל-N על ידי חיפוש מסות מונואיזוטופיות. אשר התפלגויות איזוטופיות באמצעות מרווח מסה למטען כדי לקבוע יונים טעונים כפולים ומשולשים עם סף שטף יונים מינימלי של 1,000 יונים לשנייה. המר את ספקטרום המסה הגולמי עבור יחסי מסה למטען למסות מונואיזוטופיות ניטרליות. לאחר מכן העלה את המסות המונואיזוטופיות לכלי מקוון לחיזוי מבנה אוליגוסכריד כדי לקבוע הרכבי גליקן פוטנציאליים. אשר ביאורים באמצעות מסד נתונים של גליקו שנאסף בניסוי. ודא שכל זיהוי נמצא בטווח של 2.5 חלקים למיליון שולי דיוק מדידת מסה, מכיל את הליבה ומבנה הגליקן המקושר, ואינו כולל פנטוז, 3-deoxy-d-manno-oct-2-ulosonic acid, או חד-סוכרים של חומצה אורונית. ריכוזי החלבון המיטוכונדריאלי שהתקבלו משישה תכשירים עצמאיים לא הראו שונות משמעותית, מה שמאשר יכולת שחזור גבוהה. ניתוח דם מערבי הראה ביטוי CoxIV רק בשברים המיטוכונדריאלים ו-GAPDH רק בשברים ציטופלזמיים, מה שמאשר את טוהר הבידוד המיטוכונדריאלי והיעדר זיהום שאינו מיטוכונדריאלי. מבני N-גליקן מובהקים של סיאליל, זרחן וסולפט זוהו בתמציות מיטוכונדריאליות באמצעות IR-MALDESI. ערכים ריבועיים גבוהים הבודקים התאמה טובה אישרו את גילוי הגליקנים המקושרים ל-N עם תוספות כלור אחת ושתיים, ואישרו את זיהוי תרכובות הגליקן הללו באמצעות IR-MALDESI.