הכנת רקמה שלמה לאנליזה מיקרוסקופית של שכבת תאי האנדוספרם בזרעי ארבידופסיס מתפתחים ובוגרים

אחד מתחומי המחקר שלנו הוא מדע הזרעים. אנו שואפים לענות על השאלה כיצד אנדוספרם תורם לנביטת זרעים. בדיקת מבחנה הנקראת בדיקת עיכוב צמיחת זרעים חשפה חשיבות פיזיולוגית של האנדוספרם בנביטת זרעים. זרעי הארבידופסיס קטנים למדי, והמיקום של שכבת התא האנדוספרם נמצא מתחת לאשכים, שהם התאים. זה מאתגר להכין דגימות אנדוספרם ללא קיבוע כימי. ניתוח קודם של ניתוח האנדוספרם השתמש בדגימות קבועות כימית, כך שהם לא הצליחו לצפות בתנועת חלבוני האורגניזם. הפרוטוקול שלנו מאפשר הדמיה של חמישה תאים של הדינמיקה של תאי אנדוספרם. הפרוטוקול שלנו יכול להתבצע באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי ומאפשר תובנה מעמיקה יותר של האירוע הבין-תאי ומנגנוני המולקולה ותפקוד האנדוספרם הרגיל.

[קריין] כדי להתחיל לגדל צמחי ארבידופסיס על אדמה או צמר סלעים עד לשלב הפריחה. סמן פרחים שנפתחו במלואם בחוטים צבעוניים כדי לציין אפס ימים לאחר הפריחה. בחר סיליקיות בין 12 ל -16 יום לאחר הפריחה להליך הבא. בעזרת מספריים עדינים חותכים את הסיליקונים המתפתחים המסומנים בפדיקל ואוספים אותם בצינורות של 1.5 מיליליטר. הכן נייר סינון רטוב לדיסקציה כדי למנוע התייבשות והנח את הדגימה מתחת למיקרוסקופ סטריאו. שימוש בשני מלקחיים, האחד עם קצוות עבים לאחיזה והשני עם קצוות חדים לקריעה. פיצול שסתום מהשזיף. לאחר מכן השתמש במלקחיים עם קצות סגורים, הרם בעדינות זרעים מתפתחים מהסיליקיות כדי למנוע פגיעה בהם. בשימוש במחט הזרקה בגודל 27, צור צלקת בגודל של כ-0.1 עד 0.2 מילימטר על האשך והאנדוספרם המקיפים את העובר. החזיקו את הזרע בעזרת מלקחיים מבלי למעוך אותו וצרו את הצלקת בצומת הקוטילדון והרדיקלי. כעת, דחפו את העובר החוצה על ידי צביטת הזרע במלקחיים, הקפידו לא לרסק את מעטפת הזרע ולשמור על צורתו העגולה. הכנס את מחט ההזרקה למעטפת הזרעים הריקה בצלקת ונקב אותה מבפנים החוצה. לאחר מכן, שמור את המחט במקומה והשתמש במלקחיים סגורים כדי לשרוט את פני השטח של הטסטה. לאחר מכן חותכים צד אחד של מעטפת הזרע כדי לאפשר לה להיפתח. כעת בעזרת מלקחיים חדים, פתח את מעטפת הזרע לסדין. הדגימה המבודדת צריכה להיות כעת יריעה דו-שכבתית המורכבת מאנדוספרם וטסטה. מניחים זרעי Arabidopsis יבשים בצינור של 1.5 מיליליטר ומוסיפים אליו מיליליטר מים מזוקקים כפולים. שמור את הזרעים ספוגים לפחות 40 דקות בטמפרטורת החדר. הכן נייר סינון רטוב על הבמה של מיקרוסקופ הסטריאו לדיסקציה ובעזרת מיקרו פיפטה של 1000 מיקרוליטר, העבירו את הזרעים הספוגים על נייר הסינון הרטוב. כעת הניחו את הדגימה מתחת למיקרוסקופ סטריאו. בעזרת מחט הזרקה יוצרים צלקת בגודל של כ-0.2 מילימטר על האשך והאנדוספרם המקיפים את העובר. החזיקו את הזרע בעזרת מלקחיים מבלי למעוך אותו, וכוונו את הצומת בין הקוטילדון לרדיקל לצלקת. כעת דחף את העובר החוצה לאחר צביטת הזרע במלקחיים. הימנע מריסוק מעטפת הזרעים הריקה ושמור על צורתה העגולה. בעזרת מחט הזרקה, חותכים את הצד העליון והתחתון של מעטפת הזרעים הריקה כדי לעצב אותה לצורה גלילית. לאחר מכן, חותכים את מעטפת הזרע הגלילית לאורך הציר המרכזי שלה כדי לפצל אותה לשני חלקים. התוצאות צריכות להיות יריעות דו-שכבתיות עשויות אנדוספרם ואשכה. הניחו את דגימות האנדוספרם המבודדות כיריעות על מגלשת זכוכית והרכיבו אותן במים. לבסוף, הנח בעדינות החלקת כיסוי מעל הדגימה וודא ששכבת האנדוספרם פונה כלפי מעלה לכיוון החלקת הכיסוי. השתמש בלק או בגריז כדי לאטום את שולי החלקת הכיסוי ולמנוע התייבשות לפני התבוננות בדגימה במיקרוסקופ. תאי אנדוספרם רבים והמבנים התוך-תאיים שלהם הודגמו בהצלחה מזרעים שנקטפו 14 יום לאחר הפריחה באמצעות פרוטוקול ההכנה שנקבע. גופי צילום זוהו בתוך גרעין תאי האנדוספרם, המבטאים PHYB-GFP באור לבן, המאשרים את נוכחותם ולוקליזציה גרעינית. תאי אנדוספרם הראו היווצרות גוף פוטו הפיכה בחשיפה לאור אדום ואדום לסירוגין המאשרת הפיכות צילום PHYB ופעילות ביולוגית עד 4.5 שעות לאחר הדיסקציה. הדמיה פלואורסצנטית של המיטוכונדריה בתאי אנדוספרם שלמים לאחר שלוש שעות של עיכוב זרעים בוצעה וזוהתה תנועה מיטוכונדריאלית. תנועתיות מיטוכונדריאלית דינמית יותר נצפתה בתאי אנדוספרם לאחר יום אחד של עיכוב זרעים, מה שמעיד על פעילות מוגברת לאורך זמן.