זיהוי מיני מיקובקטריום בשיטת שבב מיקרו-מערך DNA

[קריין] מחקר זה מתמקד באבחון מולקולרי במיקרוביולוגיה קלינית. בהשוואה לשיטות זיהוי מסורתיות, שיטת שבב המיקרו-מערך של DNA לזיהוי מיני מיקובקטריום היא רגישה מאוד, ספציפית ומהירה, מה שיכול לספק סיוע חשוב לאבחון מוקדם של חולים קליניים. נכון לעכשיו, שיטות זיהוי מהיר של מיקובקטריות שאינן שחפתיות מוגבלות במעבדות עממיות רבות, מה שמשפיע ישירות על האבחון והטיפול הקליני של המטופלים. כדי להתחיל, הגדר את הטמפרטורה של אמבט המים בטמפרטורה קבועה ל 50 מעלות צלזיוס וחמם אותו מראש. להכנת צ'יפס, הוסף 200 מיקרוליטר מים מזוקקים לתחתית קופסת הכלאת השבבים של מיקרו-מערך הגנים. הנח את התושבת בין שני עמודי המיקום בתוך הקופסה. הנח בזהירות את השבב כשהצד הקדמי כלפי מעלה על התושבת וכסה אותו בתלוש הכיסוי כך שיהיו ארבעה בוסים עם הפנים כלפי מטה, וודא שקצה החלקת הכיסוי מיושר עם התווית בקצה השבב. לאחר מכן, הכינו צינורות צנטריפוגה של 200 מיקרוליטר, או שמונה רצועות באר לפי מספר הדגימות ותייגו אותן כראוי. מחממים את מאגר ההכלאה מהערכה בחום של 50 מעלות צלזיוס עד להמסה מלאה. לאחר ערבוב יסודי, צנטריפוגה אותו במהירות במיקרו צנטריפוגה. יש לשים תשעה מיקרוליטרים של מאגר הכלאה לכל צינור או רצועה מוכנים. הוסף שישה מיקרוליטר של מוצר ה-PCR המתאים לכל צינור, ויצר נפח סופי של 15 מיקרוליטר לתערובת תגובה. מחממים את תערובת תגובת ההכלאה ל-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי לנטרל אותה באמצעות מכשיר PCR או אמבט מים. לאחר טיפול הדנטורציה, טבלו מיד את התערובת בתערובת מי קרח ודגרו למשך שלוש דקות. מוציאים את תערובת תגובת ההכלאה מאמבט הקרח ומערבבים אותה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה פעמיים. כאשר לא נותר משקע פלוקולנט לבן, הוסף 13.5 מיקרוליטר מתערובת התגובה דרך חור הטעינה של החלקת הכיסוי. כסה ואטום במהירות את תיבת ההכלאה ורשום את מספר השבב, מיקום המיקרו-מערך ומספר הדגימה. כעת, הנח את קופסאות ההכלאה האטומות אופקית לתוך אמבט המים בטמפרטורה קבועה שחומם מראש ל -50 מעלות צלזיוס. לאחר הנחת כל הקופסאות בפנים, הפעל את הטיימר למשך 120 דקות. לאחר השלמת תגובת ההכלאה, הוציאו את קופסאות ההכלאה בצורה אופקית, פרקו אותן ואחזרו את השבבים. הנח מיד את הצ'יפס על מתלה השקופיות בתוך מיכל מלא בתמיסת שטיפת שבבים I שאוזנה לטמפרטורת החדר ושטוף אותם בטמפרטורה של 80 עד 100 סל"ד על שייקר בטמפרטורה קבועה למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את הצ'יפס שוב עם Chip Washing Solution II על השייקר המכוון ל-80 עד 100 סל"ד למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. כעת, הכניסו את הצ'יפס לצנטריפוגה וסובבו בחום של 100 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הפעל את הסורק. ולאחר מכן פתח את התוכנה המתאימה. לחץ על בקרת לייזר כפתור כדי לאפשר לו להתחמם מראש למשך 10 דקות. הזן מידע הקשור לדוגמא לתוכנה. לאחר שהסורק מסיים את החימום מראש, לחץ/י על הכפתור ״הוצא״. הניחו את השבב המיובש בהתמדה על חתיכת התושבת הקטנה. דחוף את השבב בעדינות ואופקית לתוך תא הסורק ולחץ על כפתור הטעינה. כעת, הזן את מספר השבב לתוכנה ולחץ כדי לבחור את אזור הזיהוי מיקרו-מערך 1 עד 4. לחץ על בחר דגימה כדי לבחור את הדגימות המתאימות לכל מיקרו-מערך. לאחר מכן לחץ על התחל זיהוי כדי להתחיל בסריקת שבבים. תוצאות הסריקה יוצגו על המסך ויישמרו אוטומטית. השתמש בדף שאילתת הנתונים כדי לבצע שאילתות נתונים ופעולות הדפסה. לאחר השלמת כל הפעולות, כבה את הלייזר, צא מהתוכנה ולבסוף, כבה את הסורק. תוקף תוצאות הניסוי מאושר על ידי בקרת איכות כאשר הבקרה החיובית מניבה תוצאת זיהוי של קומפלקס מיקובקטריום טוברקולוזיס והבקרה השלילית לא הניבה מיקובקטריום. פרשנות של דגימות בדיקה מתחילה במקרים שבהם כל הבדיקות, כולל זו עם ערך האות הגבוה ביותר, שליליות, וכתוצאה מכך דיווח על היעדר מיקובקטריום. בדגימות שבהן רק בדיקת קומפלקס מיקובקטריום טוברקולוזיס מראה אות חזק, התוצאה מזוהה כחיובית עבור אותה קבוצת מינים. אם הגשושית המתאימה ל-mycobacterium avium היא היחידה עם אות חזק, הדגימה מזוהה כחיובית ל-mycobacterium avium. אם רק בדיקת הבקרה הפנימית חיובית וכל האחרים שליליים, התוצאה מדווחת כבלתי מוגדרת, מה שמעיד על נוכחות של מין מיקובקטריום שאינו מכוסה על ידי ערכת הזיהוי.