אלסטומרים מגנטו-ריאולוגיים מיקרו-דפוסיים להנעת שינויים ביישור קרדיומיוציטים

אנחנו חוקרים כיצד קרדיומיוציטים מגיבים לשינויים דינמיים הפיכים בסביבתם המכאנית, ומחקים את התנודות בקשיחות ובמבנה שהם חווים ב-vivo. מאז כניסת ה-MRE, פרסמנו מספר מחקרים חשובים בקרדיולוגיה. באמצעות חומרים אלו, מצאנו כי היפרטרופיה המונעת על ידי קשיחות בקרדיומיוציטים בוגרים תלויה ברשתות המיקרוטובולים.

לאחרונה גילינו מידע נוסף על זיכרון מכני הן בפיברובלסטים של הלב והן בקרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC. החלק הטוב ביותר בשימוש באלסטומרים מגנטוריאולוגיים הוא הפשטות שלהם. הפרוטוקולים שלנו פשוטים כפי שזה נשמע, פשוט שילוב של מוצרים מוכנים שעובדים יחד ליצירת משהו עוצמתי.

זו גישה קלה לשימוש שהופכת מדע מתקדם לנגיש לכולם. זה סלל את הדרך למודלים ריאליסטיים יותר של מחלה, במיוחד במצבים כמו אי ספיקת לב, שבהם המכניקה של הרקמה משתנה כל הזמן. הוא גם מסייע לחוקרים לעצב חומרים ביולוגיים חכמים יותר, שהם מאוד גמישים, דינמיים והפיכים.

הצוות שלנו התמקד בעיקר במחלות לב, אך לאחרונה הרחבנו את טווח ה-MRE הדינמי והקשיח ביותר שלנו מ-5 קילופסקל נמוך עד 400 קילופסקל. הפריצה הזו פותחת לנו את הדלת להרחיב את המחקר ולשתף פעולה באיברים אחרים מעבר ללב. כדי להתחיל, מערבבים את הבסיס וסוכן העיבוד ביחס של 10 ל-1 להכנת 10 גרם של 184 פולידימתילסילוקסן (PDMS).

שפכו חמישה גרם מ-184 PDMS לתוך צלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ. לאחר מכן מניחים את המנה במייבש ומנקים גזים למשך כחמש עד עשר דקות עד שכל הבועות מתפזרות. אפשר ל-184 PDMS להתייבש חלקית למשך 30 דקות בתנור בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס.

כאשר נותרו חמש דקות לייבוש, יש להניח שכבה דקה של 184 PDMS נוספים על פני השטח של רשת העקיפה. שים אותו במייבש לניקוי גזים למשך כחמש דקות. עכשיו, הוציאו את צלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ עם 184 PDMS שהתקשו חלקית מהתנור.

הפוך את רשת הדיפרקציה עם PDMS אל 184 PDMS שהתקשה חלקית בצלחת. לחץ בעדינות על רשת הדיפרקציה עד שכמות קטנה של PDMS מוקפת אותה. השתמשו ב-184 PDMS הלא מיובשים שנותרו כדי למלא את הצלחת סביב הסורג ולוודא שהיא נשארת במקום בזמן הקיבוש.

לאחר מכן מכניסים את המנה לתנור שמכוון ל-60 מעלות צלזיוס למשך שעה וחצי. לאחר הקיבוש, הוציאו את התבנית עם הסורג מהתנור. השתמש בסקלפל כדי לסקור סביב רשת הדיפרקציה.

מרח כמות קטנה של אלכוהול איזופרופיל כדי לחדור מתחת לרשת העקיפה. למשוך את הרשת מה-PDMS בכיוון המקביל לדפוסים. הסר כל עודף PDMS, והשאיר רק את החלק המעוצב שלם.

לאחר מכן חתכו את חותמת ה-PDMS לגודל הרצוי. סמן את כיוון התבנית על צלחת ה-MRE. כדי לצפות את הבול בסילן, מניחים את חותמת 184 PDMS המיוצר בתוך חומר ניקוי פלזמה חמצן כאשר המשטח המעוצב פונה כלפי מעלה.

טפל במשטח ב-45 וואט של פלזמת חמצן למשך 30 שניות. הניחו את חותמות ה-184 PDMS המטופלות בתוך מייבש שממוקם בתוך מכסה אדים. עכשיו, תקרע את המכסה מצינור מיקרוצנטריפוגה.

הניחו את מכסה צינור המיקרוצנטריפוגה ליד חותמות ה-PDMS בתוך המייבש. פיפטה 20 מיקרוליטר של סילאן למכסה צינור המיקרוצנטריפוגה. סגור את המייבש ושלף ואקום כדי להתחיל ציפוי אדים.

להכנת ה-MRE, מדוד את הכמות הרצויה של מדלל סיליקון וחלק B של אלסטומר ECO. ערבבו אותם ב-2,500 סיבובים לדקה במיקסר מהירות למשך דקה. הוסיפו חלק A של אלסטומר ECO וחלקיקי ברזל קרבוניל לתערובת וערבבו שוב בקצב של 2,500 סיבובים לדקה למשך דקה אחת. באמצעות פיפטת העברה עם חיתוך הקצה, יש לחלק חמישה גרם מתערובת MRE לצלחת פטרי חדשה בקוטר 35 מ"מ.

דגז במייבש למשך כחמש דקות, ואז מתקבש חלקית 10 דקות בתנור בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס. כאשר נותרו חמש דקות לקיבוש, השתמשו בפיפטת העברה כדי להוסיף MRE לא מעובד כדי לצפות את פני השטח המעוצבים של חותמת ה-PDMS. הנח את הבול המצופה במייבש לניקוי גזים למשך חמש דקות.

הוציאו את התבנית החלקית של MRE מהתנור. באמצעות מלקחיים, הפוך את הבול המצופה הפוך על משטח ה-MRE ולחץ בעדינות. סמן את כיוון התבנית על צלחת ה-MRE.

החזרו את ההרכבה לתנור בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 25 דקות נוספות. לאחר שהחומר מתייבש לחלוטין, השתמשו בסקלפל כדי לסקור את ה-MRE בקצה התחתון של הבול בכיוון בניצב לקווי התבנית. מרחו כמות קטנה של אלכוהול איזופרופיל על אזור החיתוך סביב הבול.

לאחר מכן השתמשו במלקחיים כדי למשוך את חותמת ה-PDMS מה-MRE בכיוון המקביל לתבנית. סטריליזציה של משטח ה-MRE על ידי שטיפה עם 70% אתנול שלוש פעמים ותן לשטיפה השלישית לעמוד 20 דקות. לאחר מכן שטוף את משטח ה-MRE שלוש פעמים עם PBS סטרילי.

ציפוי את פני השטח של ה-MRE ב-10 מיקרוגרם למיליליטר פיברונקטין ב-PBS המכיל מגנזיום וסידן למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לעודד הידבקות תאים למכשיר. לבסוף, שטפו את משטח ה-MRE שלוש פעמים עם PBS המכיל מגנזיום וסידן, וזרעו את הקרדיומיוציטים של חולדות התינוקות בצפיפות של 20,000 תאים לסנטימטר רבוע. הדיוק של העברת המיקרודפוס מהתבנית הראשית למצע ה-MRE מודגם באיור זה באמצעות פרופילי גובה מנורמליים ומדידות כמותיות של גובה התכונה והגובה.

השוואת פרופיל X הראתה שפרופיל גובה התכונות המנורמל של ה-MRE דומה מאוד לזה של תבנית המאסטר, אם כי עם גבהי שיא מעט מופחתת וצורות תכונה רחבות יותר. הגובה הממוצע של תת-ה-MRE היה כ-10 מיקרומטרים ולא היה שונה משמעותית מהגובה של תבנית המאסטר. גובה התכונה הממוצע על מצע ה-MRE היה נמוך משמעותית מזה של התבנית הראשית, עם ערכים ממוצעים של 3.81 מיקרומטרים ו-5.49 מיקרומטרים, בהתאמה.