במבחנה תרבית לתאי T ברווז ספציפיים ל-H5N1 וזיהוי תגובות חיסוניות בשיטת צביעת ציטוקינים תוך תאית

אנו שואפים להקים פרוטוקול מבחנה לתרבית תאי T ברווז ספציפיים ל-H5N1 ולכמת הפרשת IFN-γ באמצעות צביעת ציטוקינים תוך תאיים. מחקרים אחרונים מדגישים את החשיבות של חסינות תאי T של עופות בשליטה על זיהומים נגיפיים, אך שיטות תרבית סטנדרטיות עדיין חסרות לברווזים. גידלנו בהצלחה תאי T ברווז ספציפיים ל-H5N1 ופיתחנו פרוטוקול ICS חדש מבוסס זרימה מקטעים לזיהוי ביטוי IFN-γ ברווז. נחקור תגובות תאי T ספציפיות לאנטיגן במיני עופות אחרים ונפתח כלים אימונולוגיים של עופות להערכת חיסונים ומחקר אנטי-ויראלי.

[קריין] כדי להתחיל, בודדו תאים חד-גרעיניים בדם היקפי זיכרון, או PBMCs, מברווזים שנדבקו בנגיף H5N1 28 יום קודם לכן, והתאימו את ריכוז התאים המבודדים ל-3 כפול 10 בחזקת 6 תאים למיליליטר. כעת, חלקו 1 מיליליטר מהמדיום לכל באר של צלחת של 48 בארות. לאחר מכן, הוסיפו את נגיף שפעת העופות H5N1 ל-PBMCs בריבוי הדבקה של 5 כדי להדביק את התאים, ודגרו על התרבית המשותפת למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס. כל 15 דקות, יש לנער בעדינות את הצלחת ביד כדי להבטיח פיזור אחיד. לאחר שעה אחת של הדבקה, שטפו את ה-PBMCs פעמיים עם PBS כדי להסיר חלקיקי נגיף לא קשורים. השעו מחדש את ה-PBMCs השטופים ב-1 מיליליטר של מדיום תרבית תאי T ודגרו את התרחיף ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמש שעות. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים ב -440 x גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השעו מחדש את התאים המציגים אנטיגן, או APCs, ב-100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאי T, והוסיפו את ה-APCs המורחפים לתאי האפקטור ביחס של 1 עד 5. כעת, דגרו את התרבות המשותפת באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס למשך 14 יום. כל יומיים, הסר מחצית מהסופרנטנט בעזרת פיפטה. השליכו את המדיום המשומש המכיל תאים והוסיפו נפח שווה של מדיום תאי T טרי. ביום השביעי, התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ אופטי ב-100x. טפל בקבוצה נפרדת של נגמ"שי זיכרון עם PBS והשתמש בהם כקבוצת ביקורת לא מגורה. ביום השביעי, הוציאו את התרביות של תאי T ספציפיים ל-H5N1 מהאינקובטור וקצרו את כל התאים מכל באר בצינור. כעת, הוסיפו את ה-APCs המודגרים ואת ברפלדין A בדילול של 1 עד 1000 לתאי האפקטור ודגרו יחד במשך שש שעות באינקובטור של 39 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, העבירו את התאים לצינור צנטריפוגה נקי וסובבו אותו בטמפרטורה של 440 x גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט. הוסיפו לתאים 100 מיקרוליטר מקוקטייל הנוגדנים המכיל נוגדן CD8 נגד ברווז בעכבר, ודגרו במשך 30 דקות בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של PBS. צנטריפוגה של התאים ב-400 x גרם למשך חמש דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר השלכת הסופרנטנט, יש להוסיף נוגדן IgG2b נגד עכברים מצומד FITC, ולדגור במשך 30 דקות בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, סובב את התאים שוב ב-400 x g למשך חמש דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר השלכת הסופרנטנט, השעו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של מאגר קיבוע ודגרו על התערובת למשך 20 עד 25 דקות בחושך ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים עם 1 מיליליטר של מאגר חדירות 1x כפי שהודגם קודם לכן. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של מאגר חדירה. דגרו על התאים עם נוגדן IFN-γ נגד ברווז בעכבר מדולל מ-1 עד 10 למשך 30 דקות בחושך ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר שטיפת התאים, יש להוסיף 100 מיקרוליטר של נוגדן IgG3 נגד עכברים מצומד PE מדולל מ-1 עד 250, ולדגור במשך 30 דקות בחושך ב-4 מעלות צלזיוס. לבסוף, נתח את הדגימות המעובדות באמצעות תוכנת FlowJo. לאחר תרבית משותפת עם תאים מציגי אנטיגן, תאי T ספציפיים לנגיף הראו צמיחת אשכולות, המעידה על התפשטות מוצלחת. תיוג אסטר Carboxyfluorescein succinimidyl חשף שיאים מרובים של חלוקת תאים בדגימות מגורות, מה שאישר התפשטות נרחבת של תאי T זיכרון ברווז. שיעור תאי CD4+ ו-CD8+ T היה גבוה משמעותית בתרביות מגורה H5N1 מאשר בבקרות לא מגורים לאחר 14 יום. תאי T מתרבים ביום השביעי של התרבית הראו ביטוי מוגבר של גנים הקשורים לציטוטוקסיות, כגון גרנזים A ואינטרפרון-גמא, מה שמעיד על פנוטיפ ציטוטוקסי. זרימה ציטומטרית הראתה עלייה משמעותית בשיעור התאים החיוביים לאינטרפרון-גמא הן באוכלוסיות תאי T CD8 גבוהים והן ב-CD8 נמוכים בעקבות גירוי אנטיגן.