חקר האירועים התאיים הרציפים של פגוציטוזיס המופעלים על ידי גודנטי בהסמה בתאי יונקים

פגוציטוזיס, שבה פגוציט בולע ומפרק חלקיקים זרים. זה חיוני להגנה חיסונית. יש צורך בשיטות משופרות וידידותיות למשתמש כדי לנטר ולהעריך ביעילות את התהליך התאי המורכב הזה.

לכידת אירועי השפלה בזמן אמת והימנעות מחפצים מהלבנת תמונות נותרו אתגרים מרכזיים במחקר מדויק של פגוציטוזיס וסחר תוך תאי. בניגוד לחלקיקים פלואורסצנטיים או סינתטיים, הפרוטוקול שלנו משתמש ב-Godanti Bhasma, חלקיק נטול תוויות המאפשר הדמיה ישירה של שלבי פגוציטוזיס ללא הלבנת תמונות, אופטימיזציה או הכנה מורכבת. ממצאים אלה מספקים מודל ניתן לשחזור לניתוח מנגנונים פגוציטיים, ומציעים כלים חדשים לחקר דינמיקה שלפוחיתית, תפקוד לקוי של פתוגנים והתערבות טיפולית פוטנציאלית להפרעות חיסוניות וליזוזומליות.

אנו שואפים לחקור את המווסתים המולקולריים של פגוזום ההתבגרות, לחקור תפקוד לקוי של פגוציטים במודלים של מחלות, ולסנן תרופות פוטנציאליות המווסתות דינמיקה שלפוחית וסחר תוך-תאי. כדי להתחיל, שקלו בדיוק 100 מיליגרם של אבקת גודנטי בהסמה או GB. השעו את האבקה ב-10 מיליליטר DMEM בתוספת 10% FBS ו-1% סטרפטומיצין פניצילין.

מערבבים היטב את התרחיף כדי לערבב את התוכן ונותנים לתערובת לעמוד דקה אחת כדי לאפשר לחלקיקים הגדולים יותר להתיישב בתחתית. בעזרת פיפטה, העבירו את חמשת המיליליטר העליונים של המתלה לצינור צנטריפוגה סטרילי. סמן את חמשת המיליליטר של תרחיף GB שהועבר כפתרון המלאי לעבודת תרבית תאים נוספת.

מערבל שוב את התרחיף ביסודיות כדי להבטיח פיזור אחיד של חלקיקים לפני הוספתו לתאים. זרע 3 10 לתאי 3T3-L1 בעוצמה הרביעית לצלחת של 35 מילימטר המכילה שני מיליליטר DMEM. דגרו את המנה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני עד שהתאים מגיעים למפגש של 70%.

לאחר מכן מערבבים היטב 300 מיקרוליטר של מתלה מלאי GB לשני מיליליטר של מדיום תרבית טרי שחומם מראש. הנח את צלחת התרבית המכילה תאים ותרחיף GB על חממת הבמה של מיקרוסקופ ההדמיה. בחר את המטרה פי 10 במיקרוסקופ.

הפעל את תאורת השדה הבהיר באמצעות כפתור בהיר. לאחר מכן הפעל את תוכנת DIGI ImagePlus ובחר את המצלמה המתאימה. לחץ על לכידה כפתור ובחר באפשרות זמן-lapse.

הגדר את זמן המרווח לחמש דקות והתחל להקליט על ידי לחיצה על סיום לחצן. צלם תמונות שדה בהיר במרווחי זמן של חמש דקות ברציפות במשך 16 עד 24 שעות בתוך חממת הפחמן הדו-חמצני בשלב המיקרוסקופ. השתמש בתוכנת ImageJ כדי להרכיב את כל התמונות שצולמו לסרטון זמן-lapse.

זה מאפשר זיהוי של שלבי הפגוציטוזה מהפנמת החלקיקים ועד לפירוקם המלא. לאחר 24 שעות של צמיחת תאים ב-96 צלחות באר, מערבבים היטב את מתלה מלאי החלקיקים GB. הוסף 30 מיקרוליטר מהמתלה לכל באר.

השתמש בבארות ללא חלקיקי GB כבקרות שליליות. דגרו את הלוחות ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות כדי לגרום להיווצרות ואקואול. להכנת תמיסה אדומה ניטרלית, ממיסים אדום ניטרלי ליצירת תמיסה של 0.5 מיליגרם למיליליטר ב-DMEM ללא סרום.

מסננים את התמיסה דרך פילטר של 0.2 מיקרומטר. להדמיה, הסר את המדיה מ-96 צלחות באר. לאחר הוספת 60 מיקרוליטר של צבע המסנן לכל באר, דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

שוטפים את הבארות שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר עודפי צבע. לאחר מכן המשך בהדמיה מיקרוסקופית. בחן את הווקואול המוכתמים תחת מיקרוסקופ באמצעות המטרה פי 20 כדי להעריך את הגודל, המורפולוגיה ומספר הווקואולים.

להכנת תמיסת מלאי בפילומיצין A1, ממיסים 100 מיקרוגרם מהתרכובת ב -50 מיקרוליטר דימתיל סולפוקסיד. ואז לדלל אותו עם 950 מיקרוליטר DMEM. לקבלת תמיסת העבודה, יש לדלל מיקרוליטר אחד מהמלאי ב -1.6 מיליליטר DMEM כדי לקבל ריכוז סופי של 0.1 ננו-מולר.

מערבבים היטב את תמיסת העבודה ומוסיפים 100 מיקרוליטר לבארות המכילות תאים בצלחות 96 הבאר. לאחר מכן דגרו את התאים בכל באר עם 30 מיקרוליטר של תרחיף חלקיקי GB כדי לחקור עיכוב של היווצרות ואקואול ופגוזום. כדי לעכב את החמצת הפגוזום, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת העבודה של בפילומיצין A1 לבארות עם ואקואולים מוכנים מראש שטופלו בעבר ב- GB. דגרו את כל הבארות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות.

הוסף 60 מיקרוליטר צבע אדום ניטרלי לכל באר. דגירה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ושטיפה של הבארות שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר עודפי צבע, ולאחר מכן נתח היווצרות ואקואול והחמצה תחת המיקרוסקופ. טפל בתאים המתורבתים עם 50 מיקרוליטר של תרחיף GB ודגר אותם למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני בתנאי ניסוי סטנדרטיים.

לאחר הטיפול יש להוסיף לתאים תמיסת תפוז אקרידין בריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר ולדגור למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להכתים ואקואולים ואברונים שלפוחיתיים חומציים. לאחר מכן, שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS סטרילי כדי להסיר כל צבע לא קשור ולהפחית את הקרינה ברקע. לבסוף, נתח את השקופיות המוכתמות מיד באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במטרה פי 20 וטווח מסנן עירור כחול של 450 עד 492 ננומטר.

להעריך את המורפולוגיה התאית ואת ספיגת תפוז האקרידין כדי להבין את הדינמיקה של הוואקולריה. לאחר 30 דקות של טיפול ב-GB, נצפו חלקיקים מחוברים לפני השטח של שלושה תאי 3T3-L1. הרחבת ממברנה דמוית הופיעה סביב החלקיק המציינת את התחלת בליעת החלקיקים.

12 שעות לאחר הטיפול, נצפו בתוך התאים ואקואולים גדולים הקשורים לממברנה המכילים חלקיקי GB. הדמיית זמן-lapse הדגימה את ההפנמה ההדרגתית והיווצרות הוואקואול בתא חי בודד במשך 4.75 שעות. חלקיקי GB בתוך ואקואולים התדרדרו בהדרגה עם הזמן והתא חזר למורפולוגיה נורמלית כפי שמצוין על ידי תחלופת הוואקואולרים.

ניתוח ציטומטריית זרימה הראה כי חלקיקי גודנטי בהאסמה מופנמים התפרקו לחלוטין תוך 24 שעות ללא חלקיקים שנותרו במדיום התרבית. צביעה אדומה ניטרלית חשפה החמצת ואקואול גבוהה משמעותית בתאים שטופלו ב-GB בכל שלושת קווי התאים בהשוואה לביקורת שהפגינו צביעה ליזוזומלית חלשה בלבד. צביעה כתומה אקרידין הראתה פלואורסצנטיות אדומה כתומה בוואקולים של תאי GB 3T3-L1 המעידה על החמצה, בעוד שתאים לא מטופלים הראו פלואורסצנטיות ירוקה בלבד.

טיפול משותף עם בפילומיצין עיכב את היווצרות הווקואולים הן בתאי 3T3-L1 והן בתאי HeLa כפי שמעיד היעדר ואקואולים בהשוואה לבקרות שלהם. לאחר טיפול בבפילומיצין, ספיגת אדום ניטרלי נחסמה ביעילות ושיבשה את החמצת הוואקואול וההתבגרות בתאים.