צינור מרקחת ליצירת יחידות טקסונומיות תפעוליות מולקולריות (MOTUs) בקרב חיפושיות גדות ומימיות

במטרה להאיץ את גילוי המינים באזורים הטרופיים המגוונים של MEGA, פרוטוקול זה נועד ליצור השערת אשכולות מינים בחיפושיות ימיות וגדות באמצעות מרקחת של ניתוח מבוסס מחשב.

צינור מרקחת זה, שהשתמש ברצף ה-DNA של COI, הוביל לראיות רבות יותר לתיחום מינים של חיפושית רפסודה מהסוג Anisostena, שהוקם בעבר רק באמצעות נתונים מורפולוגיים.

פרוטוקול זה מבקש לטפל במכשול הטקסונומי שגילוי מינים באמצעות טקסונומיה מבוססת מורפולוגיה, הנחשבת לסטנדרט הזהב בסיסטמטיקה של חרקים, הוא לעתים קרובות גוזל זמן ומבלבל עבור חיפושיות ימיות שאינן נחקרות, אך מגוונות ומאוד לא בולטות.

[עמנואל] צינור זה מייצר השערות אביזרים מולקולריות הנקראות MOTUs, ללא קשר לשאלה אם הרצף תואם את המינים הידועים לפי רצפים שאליהם מתייחסים, או אם המינים לא התגלו או לא תוארו.

עם זאת, במקום לנתח ולהשוות מאות מבנים של איברי מין של חיפושיות בבת אחת, הצינור מספק אשכולות ראשוניים שעליהם ניתן לבחון את הדגימות לספציפיות.

[קריין] כדי להתחיל, הפעל את MEGA X וטען את רצפי ה-DNA ליישור. פתח את ממשק היישור על ידי בחירת קו, לאחר מכן לחיצה על עריכה או בניית יישור ובחירה ביצירת יישור חדש. לחץ על אישור כדי לאשר את הבחירה ובחר DNA כסוג הנתונים. העבר את העכבר מעל לשונית העריכה. לחץ על הוסף רצף מקובץ. נווט לספרייה המתאימה ובחר את הרצף files לטעינה ל-MEGA. כעת, לחץ על יישור, ולאחר מכן בחר יישור על ידי ClustalW כדי ליישר את הרצפים באמצעות הגדרות ברירת המחדל ולחץ על אישור כדי להמשיך. לעריכה ידנית של הרצפים, מחק את כל התוספות על-ידי לחיצה על הבסיסים או המיקומים שנוספו ולחיצה על מקש המחיקה במקלדת. לאחר מכן, תקן מחיקות על ידי לחיצה על המקף המייצג בסיס חסר, הסרתו והקלדת הבסיס המיועד. לאחר מכן, מצא את המיקום המוקדם ביותר שבו כל הרצפים מכילים תו. לחץ על התיבה הריקה בכותרת השורה מיד משמאל למיקום זה וגרור כדי לבחור את כל עמדות ההתחלה העודפות. הקש Delete כדי לחתוך אותם. לאחר מכן, מצא את המיקום המיושר האחרון ולחץ על התיבה מימין לנקודה זו. הקש Delete שוב כדי לחתוך את הסוף. כעת, בחר את כל הרצפים ולחץ על הכרטיסייה רצפי חלבון מתורגמים. כאשר תתבקש, אמת את הקוד הגנטי כמיטוכונדריה חסרת חוליות. אם הקוד הגנטי שונה, לחץ על לא ויופיע תפריט, המאפשר לסמן את התיבה עבור קוד גנטי מיטוכונדריאלי חסר חוליות. אם קודוני עצירה המסומנים בכוכבית ביישור מופיעים על פני עמודה שלמה, לחץ על רצפי DNA ומחק את המיקום הראשון עבור כל הרצפים. שוב, לחץ על רצפי DNA, ולאחר מכן שמור את היישור בפורמט .mos או .mosx. כדי להתחיל את התיחום באמצעות מודול TaxonDNA, פתח את תוכנת TaxonDNA. לחץ על ייבוא ולאחר מכן בחר FASTA והעלה את קובץ היישור בפורמט FASTA. כעת, לחץ על מודולים ולאחר מכן בחר אשכול. הגדר את ערך הסף ל-3% וסמן את התיבה שכותרתה צור מידע בודד בכל אשכול. לחץ על צור אשכולות עכשיו כדי להתחיל לאגד ולשמור את התוצאות על ידי צילום מסך. לתיחום באמצעות שיטת Kimura 2-Parameter, פתח את MEGA ולחץ על קובץ, ולאחר מכן בחר פתח קובץ או הפעלה. לחץ על מרחק. בחר חשב מרחקים זוגיים ואשר את קובץ ה- .meg לתיחום. העבר את העכבר מעל התיבה לצד מודל או שיטה ולחץ על החץ כדי להרחיב את התפריט הנפתח. בחר את מודל 2 הפרמטרים של Kimura ולחץ על אישור כדי להפעיל את התוכנית. פתח את חלון פלט הנתונים כדי להציג את התוצאות. לחץ על קובץ ולאחר מכן בחר מרחקי ייצוא והדפסה כדי לשמור את התוצאה. פתח את מיני ההרכבה על ידי חלוקה אוטומטית למחיצות או שרת אינטרנט בהקדם האפשרי. לחץ על התיבה הכתומה שכותרתה בחר קובץ והעלה את קובץ ה- .fasta. גלול מטה ולחץ על בצע. כדי להוריד את תוצאת האשכולות, לחץ על הרשימה עבור השורה עם ציון ה-ASAP הנמוך ביותר ודירוג ערך ה-P הגבוה ביותר. לאחר מכן, כדי להתחיל את הערכת העץ, פתח את MEGA ולחץ על נתונים. לאחר מכן בחר פתח קובץ או הפעלה כדי לטעון את קובץ ה- .meg. לחץ על המודלים ולאחר מכן בחר מצא את דגמי ה-DNA והחלבון הטובים ביותר או ml כדי לקבוע את מודל ההחלפה המתאים ביותר. לחץ על אישור בתפריט העדפות הניתוח. כעת, כדי ליצור את העץ, לחץ על פילוגניה, ולאחר מכן בחר בנה ובדוק עץ סבירות מקסימלית. השתמש במודל ההחלפה המתאים ביותר על ידי לחיצה על התיבה לצד הדגם או השיטה ובחירת הדגם המתאים מהתפריט הנפתח. תחת בדיקת פילוגניה, לחץ על התיבה לצד בדיקת פילוגניה, ולאחר מכן בחר שיטת אתחול מהתפריט הנפתח. לחץ על התיבה לצד מספר שכפולי האתחול. הקלד 1,000 ולחץ על אישור כדי להפעיל את הניתוח. לאחר פתיחת החלון המכיל את העץ שנוצר, שמור את ההפעלה כקובץ .mts או .mtsx. כמו כן, שמור את הפלט כקובץ .newick וייצא את העץ כתמונת .png. לתיחום מבוסס PTP, בקר בשרת האינטרנט של PTP. לחץ על בחר קובץ והעלה את העץ בפורמט Newick. מתחת לעץ שלי נבחר שורש. בתיבה תחת שמות טקסונים של קבוצת חוץ, הזן את קבוצת החוץ על-ידי הקלדת השם של טיפ הטקסון. לאחר מכן, תחת פתרון סבירות מקסימלית, לחץ על הורד תוצאות תיחום כדי לשמור את פלט ה-PTP ML. באופן דומה, תחת הפתרון הנתמך בבייסיאן הגבוה ביותר, לחץ על הורד תוצאות תיחום כדי לשמור את פלט ה-PTP BI. למגבלה מבוססת MPTP על ידי MPTP, בקר בשרת האינטרנט MPTP. העלה את קובץ Newick על ידי גרירתו אל הריבוע האפור או על ידי לחיצה על הריבוע. לאחר טעינת הנתונים, לחץ על המשך לבחירת קבוצה חיצונית. בדף מפרט קבוצת חוץ, בחר את קבוצת החוץ על-ידי לחיצה על תיבת הסימון לצד תוויות הטקסונים של דגימות קבוצת חוץ. לאחר מכן, לחץ על בחירת הדגם, בחר MPTP ולחץ על אפשרויות הדמיה. בדף אפשרויות הפריט החזותי, קבל את הגדרות ברירת המחדל. לחץ על שלח. לחץ לחיצה ימנית על הקבצים תחת קבצים הניתנים להורדה ובחר שמור בשם כדי לשמור את התוצאות. כעת כדי ליצור את היחידות הטקסונומיות התפעוליות המולקולריות או MOTU, פתח את העץ באמצעות תוכנת עריכת תמונות או PowerPoint. צור סרגל לייצוג התוצאות של כל גישת תיחום מינים מולקולריים. אם כל הגישות מניבות תוצאות זהות עבור צביר מולקולרי נתון, ייעד את האשכול כ-MOTU בהסכמה. איור זה מציג את הסבירות המקסימלית של עץ הגנים ותוצאות האשכולות המולקולריים עבור חיפושיות בורנוס בהתבסס על רצפי COI 3-prime ושש שיטות תיחום. כל השיטות זיהו באופן עקבי ארבעה MOTUS, Byrrhinus negrosensis, Byrrhinus villarini Byrrhinus A ו-Byrrhinus B עם אשכולות זהים בין השיטות. Byrrhinus negrosensis ו-Byrrhinus villarini היו מופרדים בבירור, למרות שמקורם באותם מקומות. רצפים מארבעה מחוזות קובצו ל-Byrrhinus A, ולא הראו מבנה גאוגרפי חזק. איור זה מציג אשכולות של חיפושיות Anisostena לארבעה MOTUS, כולל Anisostena angatbuhay, Anisostena auxilium, Anisostena A ו-Anisostena B עם הסכמה מלאה בין השיטות. Anisostena auxilium חפפה גיאוגרפית עם Anisostena A ו-Anisostena B, מה שמצביע על כך שגיאוגרפיה לבדה לא הסבירה את הסטייה המולקולרית.