ייצור ניתן לשחזור של SPOT כפלטפורמת תרבות מבוססת פיגומים בתפוקה גבוהה
29 ביולי 2025
פרוטוקול זה מתעד את הייצור וההרכבה של SPOT, פלטפורמת תרבית מבוססת פיגומים בתפוקה גבוהה, בפורמטים של 96 ו-384 בארות. הוא גם מפרט את תהליך הזריעה של SPOT, הן ידני והן באמצעות מטפל בנוזלים זמין מסחרית.
המחקר שלנו מתמקד בפיתוח פלטפורמות בעלות תפוקה גבוהה ונתמכות בפיגומים עבור תרביות אורגונומיות חזקות, ניתנות לשחזור, שמקורן בחולה כדי לשפר את זרימת העבודה של בדיקת סינון תרופות ולסייע במודלים מתקדמים של מחלות.
מטפלים אוטומטיים בנוזלים, פלטפורמות הידרוג'ל הנתמכות על ידי פיגומים, טכנולוגיות איבר על שבב ובדיקות תא בודד כמו ציטומטריית זרימה ו-CYTOPs הן חלק מהטכנולוגיות הזמינות כיום.
האתגרים הנוכחיים כוללים שמירה על שלמות ההידרוג'ל, התגברות על מניסקוס ג'ל להדמיה בזמן אמת והבטחת פיזור תאים אחיד במבחנים מבוססי אורגנואידים לטווח ארוך.
הפרוטוקול שלנו מאפשר העמסת הידרוג'ל עקבית הנתמכת על ידי פיגומים, ממזער בעיות מניסקוס, תומך בתרבית אורגנואידים לטווח ארוך ומשתלב בצורה חלקה עם מטפלים אוטומטיים בנוזלים ומערכת הדמיה בעלת תוכן גבוה.
אנו נרגשים ביותר מהשימוש בפלטפורמות מידול המחלות שלנו כדי לחקור מנגנוני התקדמות מחלה בסרטן והתפתחות השמנת יתר.
[מדריך] כדי להתחיל, קח פיגום דפוס PMMA עבור 96 או 384 SPOT. חתוך את עודפי הנייר סביב האזור הכחול של הפיגום, והשאיר שוליים לבנים של חמישה מילימטרים סביב ההיקף. ודא שגודל הגיליון המתקבל הוא כ-760 מילימטרים על 1,300 מילימטרים. להכנת פיגום 96 SPOT להרכבה, הניחו חתיכת סרט פוליאתילן על תומך אקרילי קשיח. הנח את התמיכה המכוסה בסרט על משטח העבודה והניח את הפיגום על גבי סרט הפוליאתילן. יישר את קצה הסרגל בין שתי השורות הראשונות של הפיגום כדי למנוע מעקב לתוך הבארות. הנח את גלגל העקיבה בתחתית הפיגום וגלגל אותו כלפי מעלה למעלה, בהנחיית הסרגל. עבור פיגום 384 SPOT, אל תבצע ניקוב. לאחר מכן, הנח את הפיגום כשהצד המחוספס פונה כלפי מעלה על לוח PDMS, וודא שהשורות פועלות אופקית. השתמש בקו ההתחלה כדי לקבוע איזה צד מחוספס, ולאחר מכן החלק את הפיגום על הלוח כדי להסיר קמטים או בועות. הסר את שכבת המגן מהצד הלא חרוט של הקלטת הדו-צדדית. חגרו מעט את הקלטת באמצע ויישרו את שני העמודים האמצעיים של הקלטת עם הפיגום. כעת, לחץ את אמצע הסרט על הפיגום כדי להבטיח את היישור. החלק את הקלטת כלפי חוץ מהמרכז כדי להדביק אותה באופן שווה. בעזרת פינצטה, הרם בעדינות את הפיגום מלוח ה- PDMS. אחסן את הלוח לשימוש עתידי. כדי לחבר את הפיגום לסרט הבאר השני, הפוך את הפיגום כך שהצד החלק והלא מודבק פונה כלפי מעלה על שולחן העבודה. הסר את שכבת המגן האמצעית מהצד החרוט של הסרט השני כדי לחשוף שני עמודים מרכזיים. חגרו מעט את אמצע הסרט השני ויישרו אותו לעמודים האמצעיים של הפיגום, ואז לחצו על מרכז הסרט כדי לקבע אותו במקומו. אם נעשה שימוש בסרט חרוט, הסר את שכבות המגן הנותרות הסמוכות למרכז החשוף. החלק את הקלטת, החל מהאמצע ונע כלפי חוץ. כדי לחבר את הפיגום לצלחת ללא תחתית, הסר את שכבת המגן. יישר את הפיגום מתחת לצלחת ללא תחתית עם מכסה. לאחר היישור, לחץ על אמצעו על הצלחת. אם משתמשים בסרט חרוט, הסר שכבות סמוכות והחלק את הפיגום על הצלחת כלפי חוץ מהמרכז. כדי לחבר את הפיגום לסרט הפוליקרבונט, השתמש בפינצטה כדי לשחרר בזהירות את שכבת המגן מצד אחד של סרט הפוליקרבונט, ואז לקלף לאט את שכבת המגן מבלי לגרום לחריצים בסרט. חזור על התהליך עבור הצד השני, ואז הניח את הסרט בצד על שולחן העבודה. קלף את שכבת סרט המגן מתחתית הצלחת ולחץ את סרט הפוליקרבונט על הפיגום מהמרכז כלפי חוץ. לאחר מכן לחץ בחוזקה את סרט הפוליקרבונט על הפיגום כדי להבטיח שלכל באר יש גבול מוגדר. בעזרת סכין מדויקת, חתכו בזהירות את כל החומר העודף מתחתית הצלחת. לאחר הרכבה מלאה, הנח את לוחית ה-96 SPOT לתוך שקית ניילון שקופה הניתנת לסגירה חוזרת והוציא אותה מחוץ לארון הבטיחות הביולוגית. הניחו תמיכה אקרילית קשיחה מתחת לצלחת ו-clamp שניהם בפינות מנוגדות. אחסן את הצלחת במקום נקי ויבש עד לשימוש נוסף. לא נצפתה דליפה או החלפת מדיה כאשר בארות מתחלפות בצלחת 384 SPOT מולאו בפלואורסצאין ו-PBS במהלך תקופת בדיקה של 30 יום, מה שמאשר את היעילות של מחסום PMMA בשמירה על בידוד באר לבאר. אורגנואידים של גידול לבלב המבטאים GFP שנזרעו לתוך 96 לוחות SPOT נותרו ברי קיימא והתרחבו בהדרגה מיום האפס ועד היום ה-12 של התרבית. ביום ה-12, אורגנואידים שגדלו ב-SPOT הראו ביטוי חזק של ציטוקרטין 19 ו-Zonula Occludens-1, יחד עם נוכחות של מבני לומן פנימיים. תוצאות זריעת רקמות לא אופטימליות ואופטימליות ב-384 לוחות SPOT היו ניתנות להבחנה ויזואלית על ידי הגדרת קצה ואחידות חלוקת התאים. זריעה אחידה באופן עקבי הושגה על פני כל לוחות 96 SPOT ו-384 SPOT באמצעות המטפל האוטומטי בנוזלים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתעד את הייצור וההרכבה של SPOT, פלטפורמת תרבית מבוססת פיגומים בעלת תפוקה גבוהה, בפורמטים של 96 ו-384 בארות. כמו כן, הוא מפרט את תהליך הזריעה עבור SPOT, הן באופן ידני והן באמצעות מכשיר לטיפול בנוזלים הזמין מסחרית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביוטכנולוגיה
- סריקת תרופות
רקע
- פיתוח פלטפורמות בעלות תפוקה גבוהה לתרביות איברים.
- התמקדות בתרביות אורגנואידים המופקות מחולים.
- חשיבותה של השחזוריות במבחני סריקת תרופות.
- שילוב של טכנולוגיות אוטומטיות לטיפול בנוזלים.
מטרת המחקר
- לשיפור זרימות העבודה בבדיקות לסריקת תרופות.
- להקל על מידול מחלות מתקדם.
- להגביר את היעילות של טכנולוגיות איבר-על-שבב (organ-on-a-chip).
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בנייה של פלטפורמות תרבית מבוססות פיגומים.
- תהליכי זריעה עבור תרביות תאים.
- שימוש במערכות אוטומטיות לטיפול בנוזלים.
- יישום של פלטפורמות הידרוג'ל.
תוצאות עיקריות
- הרכבה מוצלחת של פלטפורמות SPOT בפורמטים של מספר בארות.
- הדגמה של שיטות זריעה יעילות.
- שיפור זרימת העבודה עבור בדיקות סריקת תרופות.
- מידול משופר של תרביות איברים המופקות מחולים.
מסקנות
- פלטפורמות SPOT מספקות פתרון חסון לסריקה בשטח רחב (high-throughput screening).
- תהליכים אוטומטיים מגבירים את השחזוריות והיעילות.
- פוטנציאל להתקדמויות משמעותיות במידול מחלות ובגילוי תרופות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך המנהלים
פלטפורמות תרבית בעלות תפוקה גבוהה המבוססות על פיגומים, כגון SPOT, נותנות מענה לבקבוקי צוואר קריטיים באונקולוגיה תרגומית על ידי אפשור של זרימות עבודה הניתנות לשחזור וניתנות להרחבה של אורגנואידים ממקור חולה (PDO). התאימות של SPOT לטיפול אוטומטי בנוזלים ולהדמיה בעלת תוכן גבוה תומכת בסינון תרופות ובמידול מחלות חסון, ומשפיעה ישירות על שלבי הגילוי המוקדמים ונקודות החלטה פרה-קליניות. פלטפורמה זו משפרת את הביטחון החיזוי ואת היעילות התפעולית בתיקי מוצרי מו"פ בתחום האונקולוגיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מידול חסון של הטרוגניות של גידולים באמצעות PDOs לצורך תיקוף פונקציונלי של מטרות.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטית על ידי שמירה על מורכבות הרקמה בפורמט מבוקר וניתן לשחזור.
- מקל על בחינה מונחית-היפותזה של התקדמות המחלה ותגובה טיפולית.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מספק תרביות PDO סטנדרטיות בעתקת תפוקה גבוהה, התואמות לפורמטים של 96 ו-384 בארות.
- מבטל ארטיפקטים של מניסקוס ההידרוג'ל, ומאפשר דימוי ואנליזה כמותית ומדויקת.
- משתלב בצורה חלקה עם מערכות אוטומטיות לטיפול בנוזלים לצורך הגדרת בדיקה ניתנת לשחזור ובקנה מידה רחב.
- תומך בהערכה אמינה של תרכובות באמצעות פיזור תאים אחיד ובידוד בין הבארות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מיישר מודלים המבוססים על PDO עם אסטרטגיות של סמנים ביולוגיים תרגומיים במחקר אונקולוגי.
- שומר על חיוניות ועל נאמנות פנוטיפית של אורגנואידים לאורך תקופות תרבית ממושכות.
- מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם-סיכונים על ידי אספקת נתונים רלוונטיים פיזיולוגית עבור תהליכי פיתוח פרה-קליניים.
שילוב צינור עיבוד וזרימת עבודה
SPOT ממקמת את תהליכי העבודה של PDO משלב הגילוי המוקדם, דרך זיהוי מובילים ועד לתיקוף פרה-קליני, ובכך תומכת באינטגרציה חלקה לתוך צינורות מו"פ של אונקולוגיה.
- ביולוגיית גילוי: מספקת פלטפורמה הניתנת לשחזור לבדיקת השערות וניתוח מסלולים במודלים מורכבים של גידולים.
- סריקה: מבטיחה מוכנות של הבדיקה ותוצרים כמותיים עבור קמפיינים של סריקת תרופות בסריקה גבוהה (high-throughput).
- אנליטיקה: מאפשרת דימיון בעל תוכן גבוה (high-content imaging) וקריאות כמותיות לצורך ניתוח השוואתי בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני באמצעות שמירה על פנוטיפים של אורגנואידים הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פתרון מדף בר-הרחבה, הניתן להתאמה לתוכניות מגוונות של אונקולוגיה ומידול מחלות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של זרימות עבודה של PDO לשם הדירות ויכולת הרחבה בין צוותי מחקר.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות של go/no-go ואת יעילות ההון בתיקי פיתוח בתחום האונקולוגיה.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תעדוף מותאם סיכון וקידום של תרופות מועמדות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בסיסית בתרביות רקמה וגישה למערכות אוטומטיות לטיפול בנוזלים לצורך סקביליות מיטבית.
- נדרשת תשתית של דימוי בעל תוכן גבוה (high-content imaging) לצורך ניתוח כמותי וקריאת תוצאות הבדיקה.
- נדרש סטנדרזציה בין-צוותית של פרוטוקולי זריעה ובקרת איכות.
- ניתן להתאמה הן לזרימות עבודה ידניות והן לאוטומטיות, מה שתומך בסביבות מחקר מגוונות.
- יש לנהל את זמן ייצור הפלטות ואת הטיפול בחומרים לצורך פעילas בתפוקה גבוהה.
