הפקת חומצה דאוקסיריבונוקלית בגנום מלא ממיני מיקובקטריום באמצעות טכניקת Cetyltrimethylammonium Bromide

המחקר שלנו מתמקד באפיון הגנטי של מיני מיקובקטריאליים ובאופיים המורכב של מחלות מיקובקטריאליות בבני אדם. אנו שמים דגש מיוחד על מיקובקטריית לא-שחפת ועל האינטראקציות שלהם עם מקרופאגים במהלך הדבקה משותפת עם מינים אחרים, במיוחד מיקרובקטריות שחפת. בנוסף, אנו מתמקדים בספציית מיקובקטריות פתוגניות, בזיהוי גנים הקשורים לאלימות, ובפולימורפיזם של נוקלאוטיד יחיד הקשור לעמידות לתרופות.

עקב דופן התא העבה, דפנות התא הליפידיות וההידרופוביות של מיקובקטריה, הפקת DNA הייתה מאתגרת ודורשת טכניקות פירוק מיוחדות כדי לפרק אותם ולשחרר ביעילות את ה-DNA הגנומי. בפרוטוקול שלנו, אנו עוסקים בהפקת DNA ממיני מיקובקטריה באמצעות שיטת CTAB כשיטה חזקה ויעילה לייצור DNA איכותי המתאים לכל ריצוף הגנום וטכניקות מולקולריות נוספות. כדי להתחיל, החום הורג את התרבית הנוזלית שנלקחה בצינור של 15 מיליליטר בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך שעה.

לאחר מכן שים את צינור ה-15 מיליליטר בצנטריפוגה וסובב בטמפרטורה של 3,220 גרם למשך 15-30 דקות בטמפרטורת החדר. באמצעות פיפטה סטרילית, השליכו את הסופרנטנט השקוף, כדי לוודא שכל המדיה מוסרת. החזירו את כדור התרבית לתלות היטב בתוך 300 מיקרוליטר של בופר Tris-EDA, והעבירו את הכדור התלוי מחדש לצינור של 2 מיליליטר.

עכשיו, הוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת ליזוזים בריכוז של 10 מיליגרם למיליליטר לצינור וערבבו על ידי פיפטינג למעלה ולמטה חמש פעמים. הקישו בעדינות על הצינור כדי להבטיח פיזור אחיד, והניחו את הצינור באינקובטור סיבובי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ודגרו אותו במהלך הלילה. ביום הבא, יש להכין תערובת של 5 מיקרוליטר של פרוטאנאז K בריכוז של 10 מיליגרם למיליליטר ו-70 מיקרוליטר של 10% SDS.

הוסיפו 75 מיקרוליטר מהתערובת הזו לכל דגימה. ערבבו את הדגימה על ידי נגיעה בצינור ודגרו בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, תוך היפוך או נקישה לסירוגין של הצינור כדי לערבב. לאחר מכן, הוסיפו לדגימה 100 מיקרוליטר של נתרן כלוריד 5 מולרים, ואחריהם 100 מיקרוליטר של תמיסת CTAB כלוריד מחוממת מראש לטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס לדגימה.

ערבבו את הדגימה על ידי נקישה עד שהתמיסה הופכת לחלבובה. הניחו את הצינור באינקובטור בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, תוך היפוך או נקישה לסירוגין כדי לערבב. כעת, הוסף נפח שווה, כ-675 מיקרוליטר של תמיסת אלכוהול איזואמיל כלורופורם ביחס של 24:1 לדגימה, ומערבב על ידי טפיחה.

הניחו את הדגימה בצנטריפוגה וסובבו בטמפרטורה של 12,000 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, באמצעות פיפטה, שואף בזהירות בין 550-600 מיקרוליטר של פאזה מימית עליונה לצינורות סטריליים בנפח 1.5 מיליליטר ותויג אותם בהתאם. הוסף 550-600 מיקרוליטר של איזופרופנול קרח לכל צינור וערבב את התכולה על ידי הפיכת הצינור מספר פעמים.

הניחו את הצינור במקפיא שמכוון ל-20 מעלות צלזיוס ודגרו במשך 30 דקות עד שעה. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור במהירות המרבית, כ-21,130 גרם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לשחרר את ה-DNA הבלתי מסיס. באמצעות פיפטה, שאיפו את הסופרנטנט מהצד הקדמי של הצינור מבלי להפריע לכדור ה-DNA.

עכשיו, הוסף 1,000 מיקרוליטר של 75% אתנול קרח לכדור, וערבב את הדגימה על ידי הפיכת הצינור מספר פעמים. צנטריפוגה את הדגימה ב-12,000 גרם למשך 30 דקות באותו כיוון שבו השתמשו בעבר. לאחר הצנטריפוגה, יש לשאוב או לדקאנט את כל האתנול מבלי להפריע לכדור.

תן לצינור להתייבש בטמפרטורת החדר במהלך הלילה או לפחות 30 דקות. לאחר מכן, מוסיפים בין 25-50 מיקרוליטר של בופר Tris-EDTA ב-pH 8 כדי להחזיר את ה-DNA, ומניחים את הצינור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. לאחר הערכת בקרת איכות, הניחו את הצינור במקפיא בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס לאחסון ארוך טווח.

תפוקת ה-DNA שהושגה באמצעות שיטת חילוץ CTAB נעה בין 190 ננוגרם למיקרוליטר ל-600 ננוגרם למיקרוליטר. יחס הספיגה של 260/280 נע בין 1.9 ל-2.0, ויחס 260/230 נע בין 1.8 ל-2.2, מה שמעיד על DNA טוהר גבוה. זוהה שיא ספיגה יחיד בקוטר של 260 ננומטר.

אלקטרופורזה בג'ל אגרוז של דגימות איכותיות הראתה רצועת DNA שלמה ובעלת משקל מולקולרי גבוה עם פירוק מינימלי. בחלק ממיני המיקובקטרים שאינם שחפת, תפוקת ה-DNA הייתה פחות מ-50 ננוגרם למיקרוליטר ויחס הטוהר ירד מתחת לטווח האידיאלי, מה שמעיד על זיהום.