מדידת גואנוזין מונופוספט מחזורי (cGMP) ברקמות מוצקות באמצעות בדיקת אימונוסורבנט תחרותית מקושרת לאנזים (ELISA)

מעבדת דכטר חוקרת מטבוליזם של תחמוצת החנקן. תחמוצת החנקן מגרה היווצרות GMP מחזורית באמצעות מפל הומאוסטזיס אדפטיבי. אנו שואפים ללמוד כיצד הזדקנות, תזונה וגורמים אחרים משפיעים על מפל זה. מחקרים קודמים מתמקדים בהיווצרות תחמוצת החנקן ובהשפעות הפיזיולוגיות הנובעות מכך על הזנחת המפל המחבר בין השניים. הפרוטוקול שלנו מודד GMP מחזורי, שליח שני במפל. הפרוטוקול שלנו פשוט, נגיש וניתן להתאמה בקלות לסוגי רקמות שונים.

[קריין] כדי להתחיל,

מניחים מרסק טישו, פינצטה וכף על קרח יבש למשך 10 דקות. שקלו עודף של רקמת חזיר כדי להסביר את האובדן במהלך הריסוק. העבירו את הרקמה למרסס המצונן המונח על קרח יבש. הבזק הקפיא את הרקמה על ידי שפיכת חנקן נוזלי לתוך המרסק ואפשר לו להתאדות לחלוטין לפני שתמשיך. לאחר מכן החזר את מכסה המרסס והכה בו 15 פעמים בעזרת פטיש. עכשיו, טרה צינור הומוגנייזר חרוזים על איזון. בעזרת הכף המצוננת והפינצטה מעבירים את הרקמה המרוסקת לתוך הצינור. פיפטה 0.1 חומצה הידרוכלורית רגילה לתוך צינור ההומוגניזציה, מה שמבטיח שהנפח במיקרוליטר הוא מכפיל של מסת הרקמה במיליגרם. לאחר מכן הומוגניזציה של דגימת הרקמה באמצעות הומוגנייזר של טחנת חרוזים. צנטריפוגה את ההומוגנאט ב-17,000 גרם למשך 30 דקות, תוך שמירה על טמפרטורת דגימה של ארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנט שנוצר לצינור מיקרו-צנטריפוגה. שוב צנטריפוגה למשך 10 דקות, תוך שמירה על טמפרטורת דגימה של ארבע מעלות צלזיוס. הכניסו אליקוט של הסופרנטנט הסופי לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה והניחו אותו על קרח. לאחר מכן, פיפטה 9.9 מיליליטר של מאגר ELISA לתוך צינור שכותרתו תקן B. פיפטה 100 מיקרוליטר של תמיסת מלאי סטנדרטית לתוך צינור B הסטנדרטי. מערבולת ביסודיות כדי להבטיח השעיה אחידה. העבר 1,000 מיקרוליטר מהתמיסה מתקן B לצינור המסומן תקן 1. לאחר מכן הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר ELISA לצינורות המסומנים בתקן 0 ובתקנים 2 עד 8. מערבולת סטנדרטית 1. לאחר מכן העבירו 500 מיקרוליטר מהתמיסה לתקן 2. ואז מערבולת סטנדרטית 2, ומעבירים 500 מיקרוליטר מהתמיסה לתקן 3. המשיכו להעביר 500 מיקרוליטר מכל תקן קודם לתקן הבא, תוך מערבולת יסודית לאחר כל מהדורה עד להכנת תקן 8. לצורך אצטילציה של הדגימות, הוסף 50 מיקרוליטר של ארבע אשלגן הידרוקסיד מולארי לדגימה של 250 מיקרוליטר. הוסף מיד 12.5 מיקרוליטר אנהידריד אצטי. מערבולת את התמיסה למשך 15 שניות. ואז פיפטה 12.5 מיקרוליטר של ארבעה אשלגן הידרוקסיד מולארי ומערבולת שוב. לצינור שכותרתו תקן 0, הוסף 100 מיקרוליטר של ארבעה אשלגן הידרוקסיד מולארי, ומיד אחריו 25 מיקרוליטר אנהידריד אצטי. לאחר המערבולת, פיפטה 25 מיקרוליטר של ארבע אשלגן הידרוקסיד טוחנת לתוך הצינור והמערבולת לזמן קצר. חזור על תוספות האשלגן הידרוקסיד והאנהידריד האצטי, ולאחר מכן מערבולת עבור התקנים הנותרים, הוסף יחס קבוע מראש של מאגר ELISA ודגימה אצטילית לצינור מיקרוצנטריפוגה. תקן מערבולת 0. העבר 50 מיקרוליטר של תקן 0 לחמש בארות המיועדות כבארות NSB ו-B naught של המיקרו-צלחת ELISA. לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר ELISA לשתי בארות NSB המכילות תקן 0. בעזרת קצה פיפטה יחיד, הוסף 50 מיקרוליטר של תקנים 1 עד 8 בבארות כפולות, החל מתקן 8 והמשך לתקן 1. מערבולת כל דגימה. לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר לבארות המתאימות בשכפול או משולש. כעת, פיפטה 50 מיקרוליטר של עוקב אצטילכולין אסטראז לכל הבארות המסומנות כ-NSB, B naught, סטנדרטי ודגימה. הוסף 50 מיקרוליטר אנטי-סרום לכל B naught, סטנדרטי ודגימה היטב. מכסים את צלחת ELISA ודוגרים בארבע מעלות צלזיוס למשך 18 שעות. לאחר הדגירה, הפוך את צלחת ELISA על מיכל פסולת כדי להיפטר מהתכולה. מלאו את הבארות במאגר כביסה באמצעות בקבוק כביסה. יש לערבב בעדינות במשך חמש שניות. לאחר מכן זרוק את מאגר הכביסה והקש החוצה את הנוזל הנותר על מגבת נייר. כעת, העבירו את המגיב של אלמן למאגר. בעבודה מהירה, השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להוסיף 200 מיקרוליטר של ריאגנט אלמן לבארות הריקות, NSB, B naught, TA, סטנדרטיות ודגימות. הוסף חמישה מיקרוליטרים של עוקב אצטילכולין אסטראז לבאר TA. לאחר מכן מכסים את צלחת ELISA ב-Parafilm. הניחו אותו בכלי מוגן לאור כדי לדגור בטמפרטורת החדר עם תסיסה למשך 60 עד 90 דקות. הסר את הפרפילם וקרא את הצפיפות האופטית ב-412 ננומטר ריכוז GMP מחזורי בכבד חזירי בקבוצת הביקורת היה כ-0.0202 ננומול לגרם רקמה. בקבוצה שטופלה בחנקות, ריכוז ה-GMP המחזורי עלה לכ-0.0364 ננומול לגרם רקמה.